1、知识目标：1.简述基因工程原理及基本操作程序。2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程操作的程序包括： 1.目的基因的获取； 2.基因表达载体的构建； 3.将目的基因导入受体细胞； 4.目的基因的检测与鉴定。,1.为什么要有“目的基因的获取”这一步？2.为什么要有“表达载体的构建”这一步？3.为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？4.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？,有了目的基因（符合人们需要的那个基因），我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，
2、是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。,含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,自学导学,第一步：获取目的基因从基因文库中获取目的基因。利用PCR技术扩增目的基因。人工合成目的基因。,阅读P9 图17,与DNA复制的不同：a.需要两种不同的引物 （不需要 ）b.高温解链 （解旋酶 ）c.Taq酶 （DNA聚合酶 ）,思考1.你能推测出由mRNA反转
3、录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,求异思维,反转录酶,核酸酶H,RNaseH,DNA聚合酶,DNA链,单链RNA,单链DNA,双链DNA,RNA链,杂交双链,1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过P
4、CR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,寻根问底,第二步：基因表达载体的构建（核心）（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤：用一定的限制酶切割质
5、粒，使其出现一个有黏性末端的切口。用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使两者结合成重组质粒。,复制原点,抗生素 抗性基因,插 入 基 因,基因表达载体模式图,启动子,终止子,驱动目的基因 转录出mRNA,RNA聚合酶识别 和结合的位点,使目的基因 的转录停止,原核基因结构,编码区,非编码区,启动子,终止子,RNA聚合酶 结合位点,非编码区,编码蛋白质的序列,对编码区的编码起调控作用,对编码区的编码起调控作用,转录,真核基因结构,编码区,非编码区,启动子,终止子,RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,非编码区,转录,加
6、工,编码蛋白质的序列,对编码区的编码起调控作用,对编码区的编码起调控作用,编码区编码蛋 白质的序列,编码区不编码 蛋白质的序列,加工,（3）基因表达载体的组成：目的基因：外源DNA分子的有效片段。启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，是负责驱动基因转录出mRNA的。终止子：位于基因尾端，起终止转录的作用。标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,2.将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植
7、物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,寻根问底,第三步：将目的基因导入受体细胞（1）概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。（2）常用的转化方法导入植物细胞：农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法 导入动物细胞：显微注射技术（最多、最有效）。 导入微生物细胞.原核生物的特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。.转化过程：,阅读P12 生物技术资料卡,阅读P13 生物技术资料卡,阅读P13 倒数第7行,思维拓展,为什么要用Ca2处理细胞？因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成
8、分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2处理，以增加细菌细胞壁的通透性。,第四步：目的基因的检测与鉴定（1）内容：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（关键）。检测目的基因是否转录出了mRNA。检测目的基因是否翻译成蛋白质。个体生物学水平鉴定：是否赋予生物特性。（2）常用的技术：DNA分子杂交技术DNA与DNA杂交。分子杂交技术DNA与RNA杂交。蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交。,目的基因片段,非目的基因片段,基因探针,1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因
9、等。必须构建上述元件的主要理由是： （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,思考与探究,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原
10、因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于
11、单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所
12、有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,思考与探究,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,思考与探究,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重
13、要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,思考与探究,提示：不管目的基因导入植物细胞、动物细胞还是微生物细胞，都必须事先将目的基因与载体结合，这样才能保证导入的目的基因稳定地保存并复制和表达。目的基因导入是否成功，还有一个检测和鉴定的过程，就是看导入了目的基因的生物是否具有了相应的遗传特性。,
