1、1.2基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,获取的方法？,构建目的？组成？,导入植物细胞、动物细胞、 微生物细胞的方法分别是？,如何判断目的基因是否成功导入受体细胞？ 如何判断导入后是否成功表达？,一、获取目的基因,主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,1、目的基因的定义,从基因文库中寻找,多聚酶链式反应（PCR）扩增,化学合成法,目的基因的核苷酸序列未知,
2、目的基因的核苷酸序列已知,（一）获取目的基因的常用方法有哪些?,初始目的基因的来源,1. 从生物中直接获取,2. 人工合成,注意：要保持基因的完整性,1、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因文库,通过对受体菌的培养而储存基因,基因文库的构建模式图,由mRNA反转录形成cDNA,mRNA DNA单链 DNA单链 RNA DNA杂交分子RNA DNA杂交分子 单链DNA单链DNA 双链DNA,逆转录,使RNA降解,复制,核酸酶H,?,?,形成氢键,基因组文库和cDNA文库的比较,小,大,无
3、,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的DNA序列.,不能够编码蛋白质的DNA序列.,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,条件：_、_、_ 、 _ .,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,模板DNA,四种脱氧核苷酸,引物,热稳定DNA聚合酶,2.利用PCR扩增目的基因,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩
4、增,指数,2n,过程：,变性、复性、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 复性：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,过程,a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化
5、,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,3.人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。,从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。用_切断目的基因，使其产生_。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切
6、口,DNA连接酶,1.过程:,二、基因表达载体的构建, 核心,2.构建目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。,3. 组成,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,思考： 表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有
7、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,
8、转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要
9、用受精卵而不用体细胞？,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,四、目的基因的检测与鉴定,检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因, 首先取出转基因生物的基因组DNA；,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:, 将含目
10、的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；, 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。,（一）检测,基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,（二）鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、
11、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原-抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因 的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,目的基因的表达和检测,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）
12、、显微注射法（动物） 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,1下列有关基因工程技术的正确叙述是（ ） A重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快 D只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达,C,当堂检测,2.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是 （ ） A基因自由组合定律 B半保留复制原则 C基因分离定律 D碱基互补配对原则,D,a,3下图
13、表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是,Aa的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构 B要获得相同的黏性末端，可以用不同种b切割a和d Cc连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 D若要获得未知序列d，可到基因文库中寻找,D,4科学家在某种植物中找到了抗枯萎的基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金茶花新品种，下列有关说法正确的是 ( ) A质粒是最常用的载体之一，它仅存在于原核细胞中 B将抗枯萎基因连接到质粒上，用到的工具酶仅是DNA连接酶 C用叶肉细胞作为受体细胞培育出的植株不能表现出抗枯萎性状 D通过该方法获得的抗枯萎病金茶花，产生的配子不一定含抗枯萎病基因,D,5.下列获取目的基因的方法中，需要模板的是 （双选） A.从基因文库中获取目的基因 B.利用PCR扩增目的基因 C. 构建cDNA文库 D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因,BC,
