1、细胞生物学实验报告脂类细胞化学（苏丹染色法）1. 实验目的：用苏丹染液对小鼠的肠系膜细胞染色，观察细胞颜色，掌握苏丹染液的染色方法。2. 实验用品：（1） 仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管（2） 实验药品：蒸馏水、甲醛钙溶液、70%乙醇水溶液、苏丹染液（3） 实验材料：小鼠3. 实验原理：（1） 由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物统称为脂类，这是一类一般不溶于水而溶于脂溶性溶剂的化合物。脂 类 是 机 体 内 的 一 类 有 机 大 分 子 物 质 ， 它 包 括 范 围很 广 ， 大 体 上 可 以 分 为 类 脂 和 油 脂 两 大 类 。 类 脂 包 括
2、 磷 脂 (phospholipids)，糖 脂 (glycolipid)和 胆 固 醇 及 其 酯 (cholesterol and cholesterol ester)三 类 。 而 油 脂 可 以 分 为 常 温 下 常 温 液 态 的 油 和 常 温 下 固 态 的 脂 肪 两 类 。 这 几 种脂 类 化 学 结 构 有 很 大 差 异 ， 生 理 功 能 各 不 相 同 。 其 共 同 物 理 性 质 是 不 溶 于 水而 溶 于 有 机 溶 剂 ， 在 水 中 可 相 互 聚 集 形 成 内 部 疏 水 的 聚 集 体 。（2） 在 固 定 细 胞 时 ， 通 常 使 用 脂 溶
3、 性 固 定 液 。 然 而 ， 鉴 定 的 材 料 是 脂 肪 时 ， 脂溶 性 的 固 定 液 会 溶 解 脂 肪 ， 致 使 把 切 片 放 到 显 微 镜 下 观 察 时 ， 观 察 不 到 被 染 色的 脂 肪 ， 只 能 看 到 脂 肪 细 胞 中 有 很 大 的 空 洞 。 最 好 的 固 定 材 料 是 甲 醛 类 的 固 定液 。 如 医 学 上 保 存 尸 体 采 用 的 是 福 尔 马 林 ， 即 40%的 甲 醛 水 溶 液 ， 本 次 实 验采 用 的 则 是 甲 醛 钙 溶 液 。（3） 光 学 显 微 镜 的 切 片 多 是 石 蜡 切 片 。 在 熔 接 石 蜡
4、 时 ， 需 要 用 到 脂 溶 性 溶 剂 ，而 脂 溶 性 溶 剂 会 溶 解 细 胞 中 的 脂 肪 ， 因 此 本 次 实 验 不 可 采 用 石 蜡 切 片 。 但 是 锇酸 固 定 的 脂 肪 不 溶 于 无 水 乙 醇 、 二 甲 苯 等 有 机 溶 剂 ， 可 以 采 用 石 蜡 切 片 。（4） 制作切片有多种方法，如冰冻切片、明胶包埋冰冻切片、本次实验采用的是操作简单的铺片法。（5） 脂类染色的原理是，染料溶于脂类显色。选择溶剂时应注意，溶剂必须既溶解的染料，又不溶解掉脂类。4. 实验步骤：（1） 用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，用镊子提起小肠，使盖玻片紧贴于肠系
5、膜。用剪子将连同盖玻片和其上粘的肠系膜剪下，反扣于已滴加甲醛钙的载玻片上，固定 15 分钟,（2） 吸蒸馏水滴于载玻片、载玻片之间冲洗，用滴管不断吸取液体以去除固定液。（3） 用 70%的乙醇水溶液代替蒸馏水重复上一步骤，进行冲洗。（4） 用苏丹染液染色 30mins。（5） 染色结束时，用吸水纸吸去多余染液。擦净盖玻片周边及表面，用显微镜观察。5. 实验结果：脂肪细胞被苏丹染液染成橘红色。细胞周围有溢出的脂肪粒，呈圆形，橘红色。10*4 显微镜下观察：10*10 显微镜下观察：10*40 显微镜下观察：6. 分析与讨论（1） 结果分析：脂肪细胞中含有大量脂肪，脂肪被苏丹染液染成橘红色，因而使
6、整个细胞呈现橘红色。某些脂肪细胞破裂，而使脂肪溢出，呈橘红色的圆球状。（2） 注意事项 在用盖玻片贴肠系膜：由于小鼠的肠系膜很小，因而应该提前缩小盖玻片的尺寸。可以用剪刀剪或用手掰小，并尽量使最后的盖玻片呈正方形。 肠系膜的选择：肠系膜是一层包裹在小肠外的很细的薄膜，这层膜的大部分地方是没有脂肪细胞的。但是，肠系膜血管的周围有一些起保护作用的脂肪细胞。因此，选材时应注意选择含有血管的肠系膜。但是有一些血管周围的脂肪细胞非常厚，肉眼可见呈白色。这样的地方是无法观察的，所以选材时还要注意材料的透明度。 染色：染色过程为 30mins，在这一过程中，染料中的水分很有可能蒸发，因此在染色过程中应不时向
7、载玻片中滴加染料。 观察：在把物镜由 10 倍转为 40 倍时，应考虑到物镜变长，可能会使镜面蹭到小鼠的小肠。在观察时可先将小肠切除，只观察肠系膜。 观察：观察时如果血管呈红色，是由于放血时没有放干净，下次实验应该注意（3） 作业：糖类的鉴定Molisch 反应（- 萘酚反应）：此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与 - 萘酚作用，形成红紫色复合物。由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与 - 萘酚一样。除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸
8、、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应只能说明有糖类存在的可能。此反应不能鉴别多聚糖如淀粉，纤维素等。Benedict 反应：班氏试剂是斐林试剂的改良（也是含有 Cu2+的碱性溶液），能使具有自由醛基或酮基的糖类氧化，其本身则变成砖红色或黄色的 Cu2O，可用来测定还原糖的存在。它利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂，其碱性比斐林试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。Bial 反应（甲基间苯二酚反应）：戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有 Fe3+存在的条件下，它与甲基间苯二酚（地衣酚）缩合，形成深蓝色的沉淀物（此沉淀物溶于正
9、丁醇）。己糖也能发生反应，产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。Molisch 反应（- 萘酚反应）： 此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与 - 萘酚作用，形成红紫色复合物。由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与 - 萘酚一样。除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应只能说明有糖类存在的可能。Seliwanoff 反应：同样的原理，将糖与浓酸作用后再与间苯二
10、酚反应，若是酮糖就显鲜红色，若是醛糖就显淡红色，由此可鉴别酮糖和醛糖。蒽酮反应：糖类经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）反应生成蓝绿色复合物。Barfoed test ： 检验单糖的一种试验。将 5ml 的 Barfoed 试剂煮沸，在保持其沸腾情况下缓慢地加入待检物。单糖还原比混合物，形成红色沉淀物；而双糖虽亦能还原，但反应甚慢，可与前者区别。 脂肪的鉴定：脂肪可用 苏丹染液、苏丹染液、油红染色进行鉴定蛋白质的鉴定：常用的试剂是双缩脲试剂。其原理是：碱性条件下，双缩脲 H2N-CO-NH-CO-NH2 可以和 Cu 离子作用生成紫色沉淀。蛋白质中有很多和双缩脲结构相似的肽键，所以可以用双缩脲试剂来鉴定蛋白质。
