1、1专题 2 微生物的培养与应用第 5 课时 微生物的实验室培养目标导航 1.了解有关培养基的基础知识，掌握无菌操作技术的有关内容。2.了解消毒和灭菌常用的方法及二者的区别。3.学会以大肠杆菌为材料进行微生物培养与分离纯化的方法。一、培养基与无菌技术1培养基(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其_的_。(2)成分：一般含有_、_、_、_ ，此外还要满足微生物对_(即生长因子 )、_以及氧气的需求。拓 展深化营养物质 定义 作用 主要来源碳源 能提供所需_的物 质构成生物体的_和一些_，有些是异养生物的_无机化合物：CO2、NaHCO3 等 ；有机化合物 ：糖类、脂肪酸、花生粉饼、
2、石油等氮源 能提供所需_的物 质 合成蛋白质、核酸以及 含氮的代谢产物无机化合物：N 2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等特殊营养物质(生长因子)生长必不可少的_ 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅 是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂(3)培养基的种类划分标准培养基种类 特点 用途_培养基 _半固体培养基 观察微生物的运动、分类、鉴定物理性质 _培养基加凝固剂，如琼脂微生物_、_、活菌计数、保藏
3、菌种_培养基含化学成分不明确的天然物质 工业生产化学成 _ 培养基成分明确(用化学成 分类、鉴定2分 培 养基 分已知的化学物质配成)_培养基培 养基中加入某种化学物质，以_不需要的微生物的生长，_所需要的微生物的生长培养、_出特定微生物 (如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素或链霉素；培养固氮菌可用无 氮培养基，如阿须贝培养基)用途_培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品_不同种类的微生物，如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)注意 病毒目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动 、植物 组织细胞中才能繁殖。常
4、用于培养病毒的是活鸡胚。2无菌技术(1)概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。注意 在微生物的实验室培养中，无菌技 术的核心是_，_。(2)无菌技术的具体内容对实验操作的_、操作者的_进行清洁和消毒。将用于微生物培养的_、接种用具和培养基等进行_。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在_进行。实验操作时应避免已_处理的材料用具与周围的物品相接触。(3)消毒和灭菌的概念消毒：消毒是指使用_的物理或化学方法杀死物体表面或内部的_(不包括芽孢和孢子 )。灭菌：灭菌是指使用_的理化 因素杀死物体内外_，包括_。消毒与灭菌的区别：两者最大的区别是_。拓
5、展深化 某些细菌在其生长发育后期，可在 细胞内形成一个 圆形的抗逆性休眠体，称为芽孢。每个细菌细胞仅形成一个芽 孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽 孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的 营养体，能直接 发育成新个体。(4)消毒与灭菌的常用方法方法 条件 作用对象_ 100，煮沸 56 min 杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢_7075煮 30 min 或 80煮 15 min 不耐高温的液体70%的酒精 对双手
6、消毒50%的石炭酸、来苏水 对空气消毒_ 一定浓度的乳酸、食醋 通过熏蒸对空气进行 消毒消毒紫外线法 紫外线照射 30 min 物体表面或空气中的微生物_ 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧对接种环、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌灭菌 _在干热灭菌箱内，160170条件下，加热 12 h耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等3_在高压蒸汽灭菌锅内，121，100 kPa，灭菌 1530 min_30 W 照射 30 min 小型接种室、接种箱等二、实验操作(一)配制培养基1配制原则(1)_(根据微生物的种类、培养目的等 )，如培养基可由简单的无机物组成；生产用培养基内可
7、加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。(2)_，注意各种营养物质的浓度和比例。(3)_，各种微生物适宜生长的 pH 范围不同，细菌 6.57.5、放线菌7.58.5、真菌 5.06.0。注意 不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要， 过高对微生物的生 长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N) 的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为 41 时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源
8、与氮源的比 为 3 1 时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大增。2配制方法(以制备牛肉膏蛋白胨固体培养基为例 )(1)培养异养菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基的营养构成培养基组分 提供的主要营养物质牛肉膏 5.0 g 碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨 10.0 g 氮源和维生素NaCl 5.0 g 无机盐H2O 定容至 1 000 mL 氢元素、氧元素(2)实验流程4提醒 合格的培养基必须灭菌效果好。培养基配制好后，要放在恒温箱中保温 12 d，若无菌落生长则说明制备的培养基是合格的。(二)纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即
9、这个菌落的细菌群体由一个大肠杆菌繁殖而来，这就需接种时尽量接种单个的大肠杆菌。1微生物接种的方法微生物接种的方法最常用的是_和_两种。(1)_通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。将_放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的_。将试管口通过酒精灯的_。将已冷却的接种环伸入菌液中，_一环菌液。将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞。_将培养皿皿盖打开一条缝隙，_将沾有菌种的接种环迅速伸入_，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端 开始往第二区域内划线。重
10、复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将_的划线与_相连。将_，放入培养箱中培养。(2)_则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将 不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作a取盛有 9 mL 水的 6 支试管灭菌，并按 10110 6 的顺序编号。b用_吸取 1 mL 培养的菌液，注入 101 倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。c从 101 倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液，注入 102 倍稀释的试管内吹吸均匀，获5得 102 倍液。依此类推。涂布平板操作a将_浸在盛有酒精的烧杯中。b取不超过 0.1 mL 的_，滴
11、加到培养基表面。c将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810 s。d用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。2注意事项(1)平板划线法操作第一步 即取菌种之前及每次划线之前都需要进行_，划线操作结束时，仍需灼烧_ 。从第二次以后的划线操作总是从_开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(2)稀释涂布平板法稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“_” ，应特别注意：酒精灯与培养皿的距离要合适。吸管头不要接触任何其他物体。吸管要在酒精灯火焰周围使用。3微生物分离纯化培养的结果作出分析与评价(1)
12、培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。(2)在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。(3)培养 12 h 和 24 h 后的菌落大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大，而菌落的位置不动，只是菌落数增多。(4)频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在 4冰箱中，第 36 个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，菌种容易被污染或产生变异；后者将菌种与无菌甘油等量混合后保存在20的冷冻箱中。4菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使
13、用的菌种，我们可以采用_法；对于需要长期保存的菌种，可以采用_法。将菌种放在低温环境中保藏的目的是_，但时间长了菌种还是要老化的，因此对临时保存的菌种_ 个月后需重新接种。知识点一 培养基与无菌技术1不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以 CO2 为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是( )A氮源物质为该微生物提供必要的氮素B碳源物质也是该微生物的能源物质C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D水是该微生物的营养要素之一2下列说法正确的是( )A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C除水以外的无机物只能提供无机盐D无机氮源不可能提
14、供能量知识点二 大肠杆菌的纯化培养3有关平板划线操作的叙述，不正确的是( )A第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种C在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液6D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染 操作者4下列为某 同学在培养金黄色葡萄球菌实验中的部分操作步骤，其中正确的是( )A培养基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接补充蒸馏水至 100 mLB培养基配制完毕可直接使用C加压至 100 kPa 之前，要彻底排出锅内的冷空气D将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，灭菌后立即伸入
15、菌液试管内挑取少量菌种一、选择题1关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，叙述错误的是( )A操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C待培养基冷却至 50左右时进行倒平板D待平板冷却凝固约 510 min 后，将平板倒过来放置2金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒，下述实验结束后的做法错误的是( )A对接种环进行灼烧 处理B带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉C带菌培养基必须经加热后才能倒掉D接种后双手必须经肥皂洗净，再用 75%的酒精棉球擦拭3防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是( )A
16、实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒B接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌C在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染D使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境4下列叙述错误的是( )A右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近B倒平板整个过程应在火焰旁进行C打开培养皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖D为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置5有关稀释涂布平板法的说法中，错误的是( )A用移液管把菌液从一支试管转移到下一支试管后，要用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸三次，目
17、的是使菌液与水充分混匀B移液管需经过灭菌C试管口与移液管应在离火焰 12 cm 处D涂布时可转动涂布器，使菌液涂布均匀6以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序正确的是( )A计算称量倒平板溶化 灭菌B计算称量溶化倒平板 灭菌C计算称量溶化灭菌 倒平板D计算称量灭菌溶化 倒平板7为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )A对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法B临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上C临时保藏的菌种容易被污染或产生变异D对于需要长期保存的菌种，可以采用低温 4保藏的方法8有关平板划线操作的叙述，正确的是( )7A使用已灭菌的接种环、培养皿
18、，操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C把皿盖打开，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放入培养箱中培养二、简答题9某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料：_、_、_、_、_。其中提供氮源的是_；提供碳源的主要物质是_。(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，故配制培养 基时各
19、成分要有合适的_。在烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止_。(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若 干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入_中灭菌，压力_kPa，温度_，时间_。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到 0 时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管_。(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。(5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯_( “内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环_ 后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管放入_冰箱中保藏。10下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的牛肉膏蛋白
20、胨培养基的配方。请回答：试剂 用量牛肉膏 5.0 g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0 g琼脂 20.0 g水 1 000 mL(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是_和_。培养基配制完成以后，一般还要调节 pH并对培养基进行_处理。(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_和 _两种。在接种过程中，接种针或涂布器的灭菌方法是_。(3)假设某同学发现培养基上细菌数目过多地连成一片，可能的原因是什么？_。第 5 课时 微生物的实验室培养知识清单一、1.(1)营养物质 生长繁殖 营养基质 (2)水 无机盐 碳源 氮源 特殊营养物质
21、pH拓展深化碳元素 细胞物质 代谢产物 能源物质 氮元素 微量有机物(3)液体 固体 工业生产 分离 鉴定 天然 合成 选择 抑制 促进 分离 鉴别 鉴别2(1)防止杂菌污染 保证培养的纯度 (2)空间 衣着和手 器皿 灭菌 酒精灯火焰附近 灭菌 (3)较温和 部分微生物 强烈 所有的微生物 芽孢和孢子 芽孢和孢子是否存活 (4)煮沸法 巴氏消毒法 化学药剂法 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 紫外线灭菌二、(一)1.(1)目的要明确 (2)营养要协调 (3)pH 要适宜 2.(2)计算 称量 溶化 调节 pH 分装 灭菌 倒平板(二)1.平板划线法 稀释涂布平板法 (1)平板划线法8接种环
22、棉塞 火焰 沾取 左手 右手 平板内 最后一区 第一区 平板倒置 (2) 稀释涂布平板法 移液管 涂布器 菌液2(1)火焰灼烧灭菌 接种环 上一次划线末端 (2)无菌4临时保藏 甘油管藏 降低微生物的新陈代谢速率 36对点训练1B 对于 CO2 来说，它为无机物，只能做碳源而不能作为能源物质。规律链接 微生物代谢类型与 营养的关系：营养型微生物 碳源 氮源 生长因子 举例自养型微生物 CO2、NaHCO3 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要 硝化细菌异养型微生物 糖 类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些种类需要 乳酸菌2.A 根据培养基的物理性质，可分 为液体培养基、半固体培养基和固体培
23、养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固 体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不 仅仅提供无机 盐；无机氮源有时也能提供能量，如 NH3 可以为硝化细 菌提供能量。3C 在第二区域内划线时，接种 环上的菌种来源于第一次划 线的末端。 规律链接 (1)无菌技术是微生物培养中的关键环节。掌握无菌技术操作的方法及所适用的条件。时刻建立“有菌” 观念，注意操作中的合理 灭菌，以杜绝或防止杂菌污染。(2)平板划线法和稀释涂布平板法都要求最终形成标准菌落。因 此，划 线或稀释要充分，如果培养基上长出的菌落相互重叠， 则说明划线或稀释不充分，应该重新操
24、作。4C 培养基的配制应该先加水，后加热溶化，否则培养基会被烧焦；培养基配制完毕要经过灭菌后才能使用；在高压蒸汽灭菌以前，如果高 压蒸汽 灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa 时，锅 内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底；接种时，接种环放到酒精灯火焰上灼烧灭菌是应该的，但不能立即伸入菌种试管内，否 则会将菌种烫死。达标测试1A 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠 倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量 纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至 50，用手触摸锥形瓶 刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时，进行倒平板。平板冷
25、却 510 min 后还需倒置。 2C 金黄色葡萄球菌有很强的致病力，所以在操作 时一定要做到安全防范，接种后双手用肥皂洗净，再用 75%的酒精棉球擦拭，以起到杀菌的作用；对接种环进行灼烧也可以杀灭细菌，防止污染环境；高压 蒸汽灭菌也可杀死培养基中的金黄色葡萄球菌；如果只 对带菌培养基进行加热，杀不尽其中的致病菌，因为此菌的耐高温能力很 强，会污染环境。3B 对接种环等金属用具 进行灼烧灭菌， 应放在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰处。4C 5.D 6.C7D 对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在 3 mL 甘油瓶中加入 1 mL甘油后灭菌，将 1 mL 培养的菌液 转移到甘油瓶中，与甘
26、油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存。8D 平板划线操作时要时刻注意两个问题：一是防止杂 菌污染；二是要尽可能地将菌种分离。9(1)牛肉膏 蛋白胨 水 无机盐 琼脂 蛋白胨 牛肉膏 (2) 比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 100 121 15 30 min 废弃 (4)适量水 (5)外 冷却 410(1)牛肉膏 蛋白胨 灭菌(2)平板划线法 稀释涂布平板法 蘸取酒精；引燃灭菌 (3)菌液浓度过高；培养过程中被杂菌污染；利用接种针划线时，划下一个区域前没有对接种针进行灭菌处理解析 牛肉膏和蛋白胨都是从天然物 质中提取出来的，都含有丰富的有机物，可以为微生物提供碳源和氮源。平板划线法和稀 释涂布平板法都能使菌体分散开，但如果操作不当，会使9分离效果不理想。
