1、目录摘要 3关键词 30 引言 31 生防微生物的分类 31.1 生防微生物种类 31.1.1 生防细菌 31.1.2 放线菌 41.1.3 生防真菌 41.1.4 生防病毒 41.2 微生态系分类 41.2.1 根际微生物 41.2.2 气（叶）围微生物 41.2.3 内生微生物 52 生防微生物的作用机制 52.1 产生次级代谢产物 52.2 诱导植物产生 ISR52.3 促进养分和水分吸收，提高植物的抗逆能力 62.4 竞争生态位和营养物质 63 生防微生物的应用 63.1 苏云金芽孢杆菌基因工程及应用 63.2 荧光假单胞菌用于植物病害生物防治 73.3 昆虫真菌的遗传改良 73.4
2、新型病害生防制剂Harpin 的开发 74 生防微生物展望 8参考文献 92生防微生物的研究进展摘要：由于化学农药的大量使用，带来了严重的环境污染，所以生防微生物越来越受到大家的重视。主要介绍了生防微生物的种类、生防微生物的作用机理和生防微生物在农业上的应用，以及国内外对生防微生物的研究现状，并展望了生防微生物的发展前景。关键词：生防微生物；生物防治；内生微生物；研究进展0 引言早在2000多年前，我国西汉时就有关于各种有益微生物防治土传病的记载，记载中将一些动物骨头研碎，用水煮开，存放若干天，然后将动物粪同自然发酵的骨汁混合捣乱成糊状，在把种子拌入，晾干，待天气暖和，再次拌种，使种子外面附上
3、一层厚厚的骨粪层，再次晾干，即可播种。种子经拌种后，庄稼产量是平常的十倍。在20世纪50年代，用于防病的生防菌产品有5406、G4、1013等，5406在我国应用面积达670万 hm2 ，是当时的世界记录。国际上20世纪七八十年代兴起的“促进植物生长的根细菌”统称为 PGPR（plant growth promoting rhizobacteria） ，多半用荧光假单胞菌，现在也转向使用各种微生物 1。据统计，目前已知的细菌有4800种，估计可能有4万种，已知种只占12%；已知真菌7万种，估计有150万种，已知种只占5%，如此丰富的微生物资源，为人类筛选、利用各种生防微生物提供了前提 2。生防
4、微生物的应用是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。通过自然菌株选育开发微生物农药已有久远的历史，对于农业生产的发展起到了重要作用。1 生防微生物的分类1.1 生防微生物种类自然界微生物能占有各种空间和生境（habitat）包括动植物，一株植物从幼苗到结果，其根际、体表与体内都存在着各种真菌、细菌、病毒、类菌原体和原生动物。除少数病原物以外，绝大部分不是致病菌甚至是有益的正常菌落，大致有以下几类。1.1.1 生防细菌用于防治各种植物病害的拮抗性细菌，常见的有：假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、无定形孢囊菌属、节杆菌属、产碱杆菌属、固氮菌属、肠杆菌属、欧文
5、氏菌属、黄干菌属、哈夫尼菌属、巴斯德芽菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属、和黄单胞菌属。已开发成生防农药的生防细菌有假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属等。31.1.2 放线菌放线菌是抗生素等一系列生物活性物质的重要生产者。目前世界上报道的上万种抗生素中，70%上是由放线菌产生的，且临床上使用的抗生素有三分之二来自放线菌。放线菌产生的抗生素在农作物病虫害防治方面也有重要作用，有的放线菌还有除草活性。应用广泛的有：链霉菌属、罗卡氏菌属、小单胞菌属。1.1.3 生防真菌1908年，M.C.Potter 首次报道植物病原菌可被其自身代谢产物所抑制。之后，人们相继证实了土壤中木霉菌、青霉菌、曲霉菌以及链霉菌等可
6、以产生抗生物质，也认识到真菌对防治有害生物的重要性。近年来，有些真菌类生物杀菌剂已相继问世，并广泛用于生产。生防真菌的种类繁多，目前常见的主要有木霉菌、毛壳菌、内生真菌、酵母菌、腐霉菌等。1.1.4 生防病毒昆虫病毒防治害虫最早开始于20世纪30年代，用核型多角体病毒防治欧洲云杉叶蜂等膜翅目叶蜂类森林害虫的防治，随着应用病毒防治森林害虫的成功，进一步引起了对其他害虫防治效果的研究。从20世纪70年代初，杆状病毒就被 WHO 推荐为一种安全的生物杀虫剂用于害虫防治。目前开发成商品的有美洲棉铃虫 NPV、甜菜夜蛾 NPV、菜青虫 GV、斜纹夜蛾NPV、马尾松毛虫 CPV 和蟑螂 DNV 等。1.2
7、 微生态系分类植物微生态系的微生物基本上可以分为两大类，即习居菌和暂居菌。植物不同的体表空间及其体内各组织中都有习居菌和暂居菌，这种微生物组成的特异性是在共同进化中行成的。习居菌是固定的经常生活在植物体的一些种群，故又称常驻菌或原籍菌。暂居菌是偶尔闯入或者人为引进的，又称引进菌或外籍菌。而微生物在生态系统中的分布可以分为根际微生物、气（叶）围微生物、内生微生物等。1.2.1 根际微生物1904年德国微生物学家 Lorenz Hiltner 提出了根际概念，他将根际定为根际周围、受根际影响的土体。而将根际土壤区域的微生物种群统称为根际微生物 3。根际微生物以细菌为主，并且是革兰氏阴性菌占优势。常
8、见的有假单胞菌、黄杆菌、产碱杆菌、土壤杆菌和色杆菌等。1.2.2 气（叶）围微生物Blackman 在1981年把叶围微生物的概念引入微生物生态学。叶围微生物又可以称之为叶表微生物，叶面微生物，指的是附生或寄生于植物叶部周围的微生物 4。姜广华等曾对华东地区为主的29科38属42种种子植物叶围煤污菌进行了研究，其中，属于煤污菌11种；出芽短梗霉、芽枝状枝孢、多主枝孢、大孢枝孢、链格孢、烟长壳色孢等 5。不同地区植物上煤污菌种群组合不尽相同，不同植物上的优势种也不尽相同。41.2.3 内生微生物内生微生物多指内生菌是指生活在植物体内，通常被宿主细胞膜包围或是细胞机制包围，与宿主植物互惠共生，不表
9、现植物病害特征的一类菌，包括真菌和细菌。内生菌不仅存在高等植物之中，也存在低等的孢子植物如苔藓、蕨类和地衣中。初步统计，在植物体内存在的微生物有15%是有益的，有15%是有害的，有7%利害不明显， “益”和“害”之间没有绝对界线，在适当的比例范围内不会造成危害，属正常菌群 6。按照内生菌在植物体内存在方式，可以将其分为几类:永久内生菌，暂时内生菌，兼性内生菌，专性内生菌，非专性内生菌，定点内生菌。2 生防微生物的作用机制生防微生物的作用机制一般有产生抗生素、酶类物质或植物激素、诱导植物产生 ISR空间和营养竞争等。2.1 产生次级代谢产物生防微生物能产生一些次生物质，包括一些抗生素类物质、水解
10、酶类、植物激素等。这些物质对植物抵抗病菌侵入、潜伏、扩展和蔓延都是非常重要的。抗生素类物质。抗生素是一类异源小分子化合物，在低浓度下可以对微生物的生长或代谢产生影响。在植物病害的生物防治中根部定殖的细菌产生的抗生素起着很重要的作用。抗生素主要包括双乙酰藤黄酚（Phl） 、吩嗪羧酸（PCA） 、藤黄绿脓素（pyolterin） 、吡咯菌素（pyrolnitrin） 、HCN 和丁酸内脂根际内生菌产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂物质，破坏腐霉菌卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂， Bacillus strains 能产生一些脂多肽类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用 7。产生水解酶类和
11、促生物质。生防微生物另一个重要的生防机制就是水解酶类，其分泌的酶对物质进行降解，即可给植物提供营养，又可减少植物病害的发生。单胞杆菌可产生包括几丁质在类的多种酶，几丁质酶具有分解真菌细胞壁的特性。目前某些生防菌几丁质酶基因已经被完全克隆，可以将此基因转到内生细菌中，发挥内生细菌的优势，提高防病效果 8。用内生细菌防治棉花枯萎病，可能产生某些蛋白酶降解毒素或产生抑制物抑制病菌产生致病因子达到防病的效果。2.2 诱导植物产生 ISRVan 认为根际定殖的细菌能诱导植物产生一种不同于传统 SAR（systemic acquired resistance）的另一种抗性，将其命名为根际细菌诱导抗性即 I
12、SR。其表型与病菌诱导的系统获得性抗性（SAR）相似。根际细菌调控诱导的系统抗性对许多植物如豆类、黄瓜等上的真菌、细菌、病毒有抵抗作用。用内生菌 Bacillus pumilus SE34接种基因转化豌豆，然后接种病毒，虽然细菌和真菌相互接触，真菌菌丝和细菌在根表相互作用，真菌仍保持旺盛生长而且能穿透根皮层，因此 保护机制不能依靠直接的根围拮抗 9。5一些根部定殖的假单胞菌则表现的是另外一种诱导抗病性，如水杨酸的积累被认为是引发植物抗病基因表达的重要因素，在 P.aeruginosa 中水杨酸生物合成的基因 pchA 和pchB 已被克隆，各自编码邻-香豆酸-丙酮酸裂解酶，均为 pchDCB
13、操纵子的一部分，这两种酶在离体情况下或在原位均能催化邻-香豆酸转变为水杨酸。另一类脂多糖也是重要的诱导物，其诱导系统抗性的可能机制为产生抗微生物的低分子量化学物质，如植物保卫素、木质素和富含羟脯氨酸的糖蛋白 10。诱导一些水解酶和氧化酶类，如几丁质酶、葡聚糖酶和过氧化物酶，诱导病程相关蛋白的产生等。2.3 促进养分和水分吸收，提高植物的抗逆能力一些生防细菌能帮助植物吸收营养，如内生固氮菌，某些固氮菌能提供植物高达80%的氮量。分离自松树根组织中 Bacillus strain（pw2）具有固氮酶活性，并且较容易的定殖松树根内 11。内生菌在非常恶劣的自然环境中通过增加多年生树木生理可塑性，在维
14、持森林生态系统中可能也发挥重要作用。根际内生细菌能产生某些物质刺激 VA 菌根孢子提前萌发，参与植物的养分运输，提高植物抗干旱、盐碱等能力。微生物对一些难容性无机物的转化和分解有机质改善植物营养从而能提高植物的抗病能力。国内外学者已将一些假单胞菌研制成无机磷细菌肥料施于土壤，转化难溶性无极磷，并对优良菌株的分离与有关功能机理进行了研究。根际土壤有机磷细菌主要为假单胞菌属，无机磷主要为假单胞菌属和欧文氏菌属。Annette Deubel 等研究证明，PsIA12分解葡萄糖比分解果糖、木糖、阿拉伯糖和乳糖对植物根际溶磷的能力高 12。Miroslav Vosdtka 等研究假单胞菌 P.putid
15、a 与 Glomus fistulosum 相互关系发现，假单胞菌培养物中低分子量的提取物能促进 Glomus fistulosum 生长和磷酸脂酶产生，假单胞菌可明显促进玉米生长和提高根内磷酸酶活性，其培养物能促进马铃薯和玉米生长，减少病害发生 13。2.4 竞争生态位和营养物质微生物之间竞争包括营养竞争和位点竞争，微生物的强竞争能力是发挥生物防治作用的关键，而微生物在根内的成功定殖才能真正发挥生物防治的价值，某些生物防治细菌生长速度很快，可以很快占领根围空间，使致病菌侵染时缺少靶位点。一些根际定殖内生细菌能产生噬铁素与病菌竞争铁元素，如假单胞菌 JKIY2在无铁的环境下能分泌高亲和力铁的载
16、体，在低铁条件下铁载体的分泌量减少，而在富铁环境下则不能分泌铁载体，故拥有一种对异源噬铁素的受体，能在根际获得竞争优势 14。病原微生物本身不能产生噬铁素或产生很少，所产生的噬铁素也被假单胞菌所利用，而假单胞菌能产生噬铁素，并且不被病原微生物所利用，这样病原微生物由于缺铁而不能生长繁殖。3 生防微生物的应用3.1 苏云金芽孢杆菌基因工程及应用苏云金芽孢杆菌（Bt）制剂是目前国内外产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂。6Bt 杀虫作用的主要机制是在其生长过程中产生不同类型的杀虫晶体蛋白（ICPs） 。自 1981年 Schnepf 分离了第一个 cry 基因以来，迄今全世界从 Bt 中发现并正式
17、命名的 ICP 基因已有 42 大类，总数超过 250 种。在国家 863 计划的支持下，近年我国 Bt 分子生物学的研究发展迅速。1997 以来已经克隆了 28 种 ICP 基因，占同期国际新记载 Bt 基因总数的 1/3。除 ICP 以外，Bt 以及蜡样芽孢杆菌营养生长阶段产生的另一种杀虫蛋白 VIP 亦引起了广泛注意，有的 Vip 基因对一些重要农业害虫更显特异性，因而具有很大的开发应用潜力 15。为了进一步提高 Bt 的杀虫效果，如延长持效期、扩大杀虫谱等，可以通过杀虫基因的修饰、改造、转移等基因工程手段构建新型的工程菌。在国外，已有 Conder、MVP 等 10 余种 Bt 工程菌
18、制剂投入了商业应用。在我国，也开发出多种高效 Bt 和荧光假单胞菌的组合基因工程菌剂，其中 WG001 已于 2000 年通过安全性审批，允许生产和应用 16。3.2 荧光假单胞菌用于植物病害生物防治假单胞菌属中的一些种，尤其是荧光假单胞菌（ Pseudomonas fluorescens）大量存在于植物根际，也习于定值植物根面。由于他们繁殖迅速，能产生嗜铁素和抗生素，而成为植物位点和空间微环境的有力竞争者，是研究报告较多的一类生物防治细菌。不过抗逆性能力差给生产和利用这类细菌造成一定困难。生防菌株 2P24、CPF-10 对番茄青枯菌，棉花立枯丝核菌、棉花枯萎菌具有明显的拮抗作用；P751
19、复合菌剂对松赤落叶病菌孢子的溶菌率达96.41%，对泡桐炭疽病菌和镰刀菌的溶菌率分别为 99.25%和 85.67%17。刘国奇等从韭菜根内分离筛选出来自突变菌株 P.F.NKDE2，通过拌种和拌培养土回接韭菜，能定值于韭菜跟表、根内和根围中，有明显的促生效果 18。祝新德等报道荧光假单胞菌株 M18 在离体条件下，能有效抑制甜瓜蔓枯病菌的菌丝生长，在苗期还具有诱导甜瓜幼苗生产系统性抗甜瓜蔓枯病菌的能力，在大田试验中可以保持 80%的防效 19。3.3 昆虫真菌的遗传改良在国际记载的 800 多种昆虫病原真菌中，应用效果最好的是白僵菌（ Beauveria）和绿僵菌（ Metarhizium）
20、 。这类微生物杀虫剂具有能多次感染害虫引起流行的优点，但也存在侵染过程易受环境因素影响、毒力发挥较慢等不足。昆虫真菌分子生物学和生物技术研究国内外起步稍晚，但近年来某些关键技术已取得突破。我国在国际上首次建立了球孢白僵菌（ B.bassiana）的农杆菌转化体系，并从该菌中克隆了类枯草杆菌蛋白酶基因（Bbpr1） 、几丁质酶基因（Bbchit1）和真菌孢子形成相关基因 20。新构建的含有前两种基因的工程菌较单一 Bbpr1 基因工程菌杀虫毒力提高近一倍，侵染致病时间缩短近一半。3.4 新型病害生防制剂Harpin 的开发Harpin 是一类能激活、诱导植物保卫反应和产生系统抗性的新型蛋白，最早
21、发现于梨火疫病菌（ Erwinia amylovora）的侵染机理研究。由于这类蛋白具有作用机制独特、防病和促进植物生长效果显著和环境友好的突出优点，现已迅速开发成为一类新型的“绿色农药”并进入了国际市场。我国在水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌等多种细菌的研究中发现，Harpin 不仅广泛存在，而且其基因结构具有丰富的遗传多样性。这就为这类激活蛋白作用机理的进一步研究和生防制剂的后续开发创造了良好的条件 21。74 生防微生物展望为了更好地解决生防微生物的定值问题，研究工作者在筛选分离生防细菌时目标常常选定在根际或植物内部的细菌种群。根际细菌与内生细菌作为生防因子相对于腐生细菌而言有更大的生态优势
22、，进一步扩宽根际细菌和内生细菌领域将会是生防细菌研究趋势之一。根际细菌是从根际分离的细菌，依据其对植物的作用将其分为有益菌、有害菌和中性菌等三类，其主要特点有两个方面：一是与根亲和力强，认为革兰氏阴性菌细胞壁上具有与根表面外源凝聚素相结合的结构，较易在植物根部定居、繁殖，对其占领空间和生长竞争很有利。二是拮抗性强，根际细菌是根防御病原物侵染的第一道防线，根际土壤比非根际土壤的细菌多，活动频繁，拮抗性强。从根际或根表面很容易分离到拮抗细菌。有益根际细菌又称促生根细菌，指与根有密切联系并能强定殖于根系，能促进植物生长的根际细菌。冰核细菌作为生防因子在冻杀害虫方面研究较多。冰核活性反映是由威斯康星大
23、学植物病理学家发现的。当水中有草生欧文氏（ Erwinia herbicola） 、丁香假单胞菌（ Ps.syringae） 、荧光假单胞菌（ Ps.fluorescens）等时，水容易结冰。受冰河细菌污染的植物很容易发生冻害。冰核细菌已用于制造降雪剂、人工调节天气、冷冻浓缩食品、海水淡化等反面研究 22。特别是冰核基因在应用领域里的研究工作已成国际热点，涉及细菌细胞表面展示、报告基因、病原微生物高敏检测、促冻杀虫，作物抗寒育种等多个领域，有良好的应用前景。此外，生物技术在生防科技中的应用也逐步增多。应用现代微生物技术可以选育微生物菌株，开发微生物农药，将自然存在的生防微生物中含有一些不良的生
24、物学特性进行改良，克隆优良形状的基因，这是许多传统的手段难以达到的。现代生物技术的发展，特别是基因工程的应用，给农业微生物的研究注入了新的活力，现以成为微生物遗传改良的有效途径。目前大多数微生物的研究还停留在试验室阶段走向田间是一个复杂的过程，阻碍许多生防菌田间应用的一个重要问题是菌剂的货架储藏期短，特别是由 Pseudonomas 制成的生防菌剂，这一问题表现的更为突出，对于此类制剂的研制，可以将它制成干粉剂型，以延长菌剂的储藏期，而由 Bacillus 制成的菌剂明显的优于 Pseudonomas，因为它能产生耐热抗逆的芽孢，便于菌剂的研制和菌剂的加工，这也是市场上由 Bacillus 开
25、发的菌剂较多的主要原因。其次是生防菌的防效极易受环境条件的影响，不易在根围或叶围定植。再次植物病原菌也能对生防菌的拮抗物质产生抗性 23。这些难点都要求科研工作者们不懈努力，进一步筛选高毒力菌株，研制混合菌株生防制剂，改进生产工艺，发展产品剂系列化，提高效价与毒力，规范产品质量检测技术及商品质量标准化，加强制剂的稳定性、分散性、黏着力、田间残效及货架寿命的研究，解决孢子粉含水量偏高，产品污染严重等问题，展开国外生防资源引种、检疫及风险性分析工作，为经济、安全、持续解决我国重大病虫害问题提供条件。8参考文献1贺字典, 高玉峰.生防菌在植物病害防治中的研究进展（综述）J.河北职业技术师范学院学报,
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