1、 专题五 DNA 和蛋白质技第 1 节 DNA 的粗提取和鉴定 （选修一）1、考纲要求1、理解 DNA 的理化特性及根据其理化特性而提取和鉴定的原理，初步掌握 DNA 的粗提取和鉴定方法。2、理解相关溶液的作用机理，培养学生的分析能力，通过实验使学生能够简述科学探究的基本过程。3、通过探索培养科学的怀疑精神和创新精神；通过实验结果，学生树立生命物质性的观点。二、教学重点和难点教学重点：提取 DNA 的相关 原理和步骤教学难点：提取 DNA 的相关原理和步骤三、专家建议1、在教学过程中，教师要引导学生分析插图 5-1“DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线”，使学生理解：在 NaCl 溶液浓度
2、低于 0.14 mol/L 时，DNA 的溶解度随 NaCl 溶液浓度的增加而逐渐降低；在 0.14 mol/L 时，DNA 溶解度最小；当 NaCl 溶液浓度继续增加时，DNA 的溶解度又逐渐增大。利用上述原理，可以将 DNA 溶于高浓度的 NaCl 溶液中，使其与其他物质分开。2、教师要注意引导学生认识 DNA 和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性的不同。教材在实验设计中关于去除滤液中杂质的第二、第三个方案，正是利用了上述不同的特性，从而达到分离 DNA 和蛋白质的目的。 3、教材中介绍了用二苯胺法鉴定 DNA 的方法，教师可以引导学生结合教材中的资料，利用所学的知识，采用其他的方法鉴定 D
3、NA，如电泳法、紫外灯照射法等。四、教学方法讲授法、探究法、讨论法五、教学用具教学课件6、教学过程（一）.导入新课现状：很多学校很难开展“DNA 的粗提取与鉴定” 实验原因：1.实验的成功率普遍较低；2.背景知识较多；3.操作相对复杂，学生不易准确地操控实验。 （二）、提取生物大分子的基本思路1、选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于 DNA 的粗提取而言就是要利用 DNA 与 RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。2、探究实验原理：屏幕展示表格 1NaCl2mo1/LNaC10.14mo1/LNaC10.015mo1/LDN
4、A蛋白质表格 2DNA 蛋白质 杂质95%酒精不同浓度的 NaC1 溶液可溶解或析出 DNA。95%酒精可提取 DNA。（1)、在 NaCl 溶液浓度低于 0.14 mol/L 时，DNA 的溶解度随 NaCl 溶液浓度的增加而逐渐降低；(2)、在 0.14 mol/L 时，DNA 溶解度最小；(3）、当 NaCl 溶液浓度继续增加时，DNA 的溶解度又逐渐增大。填表 1：NaCl2mo1/LNaC10.4mo1/LNaC10.015mo1/LDNA 最大 最小 变大蛋白质 解聚 最大 变小填表 2：DNA 蛋白质 杂质95%酒精不溶 可溶 可溶通过对实验原理的预习，表格的比较，使学生明确了各
5、溶液的用途，保证理解实验。3.DNA 的粗提取实验原理1）不同浓度 NaCl 中 DNA 溶解度不同。 2）DNA 与其他细胞成分在酒精中溶解度不同，DNA 不溶于酒精，细胞中某些蛋白质则溶于酒精。3）DNA 和蛋白质对酶耐受性不同：酶的专一性蛋白酶水解蛋白质。但是对 DNA 没有影响。4）DNA 和蛋白质对高温耐受性不同：蛋白质、DNA 热稳定性不同。大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。5）DNA 和蛋白质对洗涤剂耐受性不同：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对 DNA 没有影响。提取 DNA 的原理包括 DNA 的溶解性和耐受性两个方面。4.实验材料讲解本实验的目的
6、是提取 DNA 和 DNA 的鉴定，其中提取 DNA 是本实验的重点和难点。提出问题：“DNA 主要存在于什么结构上？”“如何提取 DNA？”“选什么材料好？”动物：鸡血细胞液的优点：鸡血红细胞、白细胞中都有细胞核，含大量的 DNA,既经济又易取 提醒：人和哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有 DNA，不适于作为 DNA 提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。植物：新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。达成共识：1、造适宜材料：选动物细胞，易打破细胞结构2、破坏细胞膜、核膜结构，得核物质。3、将 DNA 与蛋白质等物质分开，得 DNA4、去掉 DNA 中杂质，提纯 DNA。粗提取利用该特点，选择适当
7、的盐浓度就能使 DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。提纯DNA 不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将 DNA 与蛋白质进一步地分离。与 DNA 相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH 等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。（三）、以鸡血为实验材料进行 DNA 的粗提取为什么用鸡血细胞做实验材料？本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞核的 DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细
8、胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。 能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数 DNA，在实验中很难提取到。提取 DNA 的具体步骤（1）、制备鸡血细胞液 （2）、破碎细胞，释放 DNA （3）、溶解细胞核内的 DNA （4）、DNA 的析出提取（5）、DNA 的初步纯化提纯 （6）、DNA 的鉴定1、制备鸡血细胞液取质量浓度为 0.1 g/mL 的柠檬酸钠溶液 100 mL，置于 500 mL 烧杯中，注入新鲜的鸡血（约 180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血
9、液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置 1d，使血细胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。柠檬酸钠可防止血液凝固2、破碎细胞，释放 DNA向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎 DNA。蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA释放出来的大量 DNA 和 RNA 往往与蛋白质结合在一起，应用 34 层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。此步骤获得
10、的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等杂质。3、溶解细胞核内的 DNA在浓度较高的 NaCl 溶液中核蛋白容易解聚，游离出的 DNA 溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为 2 mol/L 的 NaCl 溶液，搅拌 1 min。注意应沿一个方向搅拌，使 DNA 充分溶解。如果使用植物材料，必须研磨充分。研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全，提取的 DNA 量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4、DNA 的析出提取将溶液中的 DNA 与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键加蒸馏水降低 NaCl 溶液浓度，使 DNA 析出。
11、实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于 DNA 分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使 NaCl 溶液的始终浓度为 0.10.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使 DNA 分子又重新溶解为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？（1）、用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；（2）、用低盐浓度使 DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。5、DNA 的初步纯化提纯如果提取的 DNA 量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导
12、致实验现象不明显，常常使制取的 DNA 粗制品不能显示出 DNA 的本色白色。为了增进实验效果，需要对 DNA 粗制品进行简单的提纯。6、DNA 的鉴定二苯胺法：DNA 与二苯胺沸水浴呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中 DNA 含量的多少有关。紫外灯照射法：用蒸馏水配制质量分数为 0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴 1 滴 EB 溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA 的紫外吸收高峰在 260 nm 处)。 电泳法：适合鉴定纯度较高的 DNA。提取 DNA 的实验操作主要步骤的目的提取 DNA 的第
13、一步是材料的选取，其目的是一定要选取 DNA 含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是 DNA 的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的 DNA 全部溶解；第三步是 DNA 的纯化，即根据DNA 的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将 DNA 与杂质分开；最后一步是对 DNA 进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。本实验中有三次过滤 ,分别有什么作用?过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液目的:获得含核物质的滤液 过滤含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液目的:获取纱布上的粘稠物 过滤溶解有 DNA 的 2mol/LN
14、aCl 溶液目的:得到含 DNA 的滤液 实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用? 第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液加速细胞的破裂第二次搅拌加 2mol/LNaCl 溶液的滤液使 DNA 与溶液混合均匀第三次搅拌加蒸馏水至 0.14mol/LNaCl 溶液稀释 NaCl 溶液,析出 DNA第四次搅拌放入 2mol/LNaCl 溶液中纱布上的粘稠物使 DNA 尽可能多的溶于溶液中第五次搅拌体积分数为 95%的酒精提取含杂质较少的 DNA总结：投影展示实验设计思路：鸡血细胞液aDNA 释放 bDNA 与蛋白质的分离 cDNA 析出dDNA 浓缩（提纯）获得鸡血细胞核物质：提核物质溶解析出溶解析出实
15、验步骤：引导学生讨论、回忆并回答目的。防止血凝。加速血细胞破裂。溶解 DNA。使 2 mol/L 的 NaCl 溶液稀释至 0.14 mol/L，促 DNA 最大限度地析出。使含 DNA 的黏稠物被留在纱布上。使含 DNA 的黏稠物尽可能多地溶于 溶液中。除去含 DNA 的滤液中的杂质。提取 DNA。A：出现蓝色 。B：无变化讨论与结论：投影给出如下讨论提纲，供学生讨论。（1）DNA 粗提取过程中的 关键是哪几步？（2）提取鸡血中的 DNA 时，为什么要除去血液中的上清液？（3）DNA 的直径约为 2 nm，实验中出现的丝状物的粗细是否表示一个 DNA 分子直径的大小？学生分组进行讨论并发表讨
16、论结果。教师对讨论进行全程指导，并与学生一起归纳总结（1）a提取鸡血细胞的核物质。应用低渗原理和机械搅拌，可得到最大量的 DNA。b析出 DNA 黏稠物。加蒸馏水要慢，搅拌要轻。c沉淀 DNA 时，必须用冷酒精。（2）提取 DNA，去除杂质是关键。由于上清液是血液中的血浆部分，不含 DNA，所以要除去（含蛋白质）。（3）实验中出现的丝状物是肉眼可以观察到的，这种丝状物的直径要比 DNA 分子的直径 2 nm 大许多倍，所以实验中出现的丝状物并不表示一个 DNA 分子的直径。实验结论：细胞中有 DNA，DNA 遇二苯胺试剂在沸水浴中变蓝色。(四)以菜花为例提取 DNA 1、鉴 定 DNA 的其他
17、方法用紫外灯照射法鉴定 DNA 效果很好。具体鉴定方法如下。（1）配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭（EB）溶液。（2）将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴 EB 溶液染色。（3）将蜡纸放在紫外灯（260 nm）下照射（暗室中），可见橙红色的萤光（DNA 的紫外吸收高峰在 280 nm 处）。2、DNA 粗提取与鉴定的另一种方法（1)材料用具新鲜菜花（或蒜黄、菠菜）。塑料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。研磨液，体积分数为 95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。(2）方法步骤ADNA 的粗提取（1）准
18、备材料：将新鲜菜花和体积分数为 95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少 24 小时。（2）取材：称取 30 g 菜花，去梗取花，切碎。（3）研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入 10 mL 研磨液，充分研磨 10 min。（4）过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨 液滤入烧杯中（有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用 1000 r/min 的旋转频率，离心 25 min；取上清液放入烧杯中）。在 4冰箱中放置几分钟后，再取上清液。（5）加冷酒精：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为 95%的酒精溶液中，并且玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液（玻璃棒不要直插烧杯底部）。沉淀 35 min 后，可
19、见白色的DNA 絮状 物出现。用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。B. DNA 的鉴定（1）配制二苯胺试剂：取 0.1 mL B 液；滴入到 10 mL A 液中，混匀。（2）鉴定：取 4 mL DNA 提取液放入试管中，加入 4 mL 二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色（不变蓝）。用沸水浴（100）加热 10 min。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化（逐渐出现浅蓝色）。七、课堂总结 这节课咱们验证了细胞是由化合物按照 一定的方式组 成的这一结论。从知识结构角度来说，一要加深对生物的物质性理解；二要掌握一般的物质提取方法；三要注意不同的化学物质要用不同的原理鉴定。从实验过程角度来说，要理解各种溶液和试剂的作用和目的。理解 DNA 的理化特性及根据其理化特性而提取和鉴定的原理，初步掌握 DNA 的粗提取和鉴定方法。理解相关溶液的作用机理，通过实验使大家能够简述科学探究的基本过程。八、板书设计专题五 第 1 节 DNA 的粗提取与鉴定一、提取生物大分子的基本思路二、以鸡血为实验材料进行 DNA 的粗提取1、制备鸡血细胞液 2、破碎细胞，释放 DNA 3、溶解细胞核内的 DNA 4、DNA 的析出提取5、DNA 的初步纯化提纯 6、DNA 的鉴定三、以菜花为例提取 DNA
