1、考点一 微生物的培养和利用,第29讲 微生物的培养、利用及浅尝现代生物技术,1.(2018浙江11月选考)回答与微生物培养及应用有关的问题：(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从_时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用_方式可较快地进行过滤灭菌。(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加_的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白质胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是_。,(3)为筛选胞外淀粉酶分泌型菌种，一般从_(A.果园树下 B.肉类加工厂周围 C.米酒厂周围 D.枯树周围)获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养
2、基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个_比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取_用于检测酶活性。,解析 (1)由于高压蒸汽灭菌锅的升温升压需要一定时间，而未达设定温度和压力将导致灭菌不彻底，因此对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，如尿素培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中过滤灭菌，采用抽滤方式可加快过滤速度。(2)相比果醋制作中先利用葡萄糖进行酒精发酵，再进行醋酸发酵，以淀粉为原料制醋，需,增加淀粉分解成糖的过程。醋化醋杆菌培
3、养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是作为碳源。(3)结合生物具有适应性的规律，米酒厂周围的淀粉量相对较多，因此存在可分泌淀粉酶的分泌型菌种。分泌的淀粉酶活性越高，数量越多，菌落周围的透明水解圈越大。由于水解圈越大，表明淀粉分解量越多，因此水解圈直径与菌落直径比值大的菌落，分泌的酶活性较高。经液体培养基振荡培养进行扩增后，再将培养液离心，菌种会分布于沉淀，而分泌的胞外酶分布于上清液，可取上清液测定酶活性。,答案 (1)达到设定的温度或压力值 抽滤 (2)将淀粉分解成糖 作为碳源 (3)C 水解圈直径与菌落直径 上清液,2.(2018浙江4月选考节选)在淀粉分离生产工艺研究
4、中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂(乳酸菌菌液)，其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用_，进行单菌落分离，然后将其_，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。答案 划线分离法(或涂布分离法) 扩大培养 3.(2017浙江11月选考节选)为了获得优良的酿酒红曲霉菌株，将原菌株的孢子诱变处理后制成较稀浓度的单孢子悬液，这样做的目的是在培养时有利于获得_。答案 单菌落,4.(2017浙江4月选考节选)回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定有关的问题：制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用_蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的
5、平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是_。,解析 从酸奶中分离乳酸菌时，可采用划线分离法，方法是用接种环蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。图示的划线分离中B图方法是正确的，A图不分区划线，但划线太稀疏，分离效果很差，B、C、D都采用了分区划线，但C、D都没有注意除第一区外，之后每区划线的第一条线都需要从上一区划线的末端开始。 答案 接种环 B,5.(2016浙江10月选考节选)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题：(1)LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加_，灭菌
6、备用。(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用_灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗_，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。,(3)取适量含产脲酶细菌的104、105两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48 h，推测固体培养基上生长的菌落数量最少的是_。 A.105稀释液尿素固体培养基 B.105稀释液LB固体培养基 C.104稀释液尿素固体培养基 D.104稀释液LB固体培养基 在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现_，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生_所致。,解析 (1)本实验中的LB培养基是要与尿素
7、培养基作对比的，所以要用琼脂糖替换琼脂。(2)尿素培养基的灭菌要分开进行，除尿素外的其他成分仍用高压蒸汽灭菌，尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，再将除菌的尿素加到已灭菌的其他成分中。G6玻璃砂漏斗由于孔径小，细菌不能滤过，可用于过滤除菌，但需要在使用前进行高压蒸汽灭菌。(3)由于在土壤中产脲酶的细菌远少于普通细菌，所以在尿素培养基上的菌落数相对少得多，另外稀释倍数高的土壤稀释液中细菌数量少，在培养基上菌落数也相对少。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现红色环带，这是因为脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂在碱性下呈红色。 答案 (1)琼脂糖 (2)高压蒸汽 孔径小，细菌不能滤
8、过 (3)A 红色环带 氨(或NH3),本题组对应与选修一P1928，微生物的利用。考查了微生物的培养和分离方法。,一、大肠杆菌的培养和分离 1.大肠杆菌(1)特性：大肠杆菌是革兰氏 性、 (代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的 系统，就会对人体产生危害。 (2)用途：是 技术中被广泛采用的工具。 2.实验内容和过程(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用 培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在 培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。,阴,兼性厌氧,泌尿,基因工程,LB液体,LB固体平面,(2)实验过程,倒平板,接种,高压蒸汽,三角瓶,一次,连续
9、划线,倒置,单个菌落,接种环,划线,斜面,37,4 冰箱,二、分离以尿素为氮源的微生物 1.菌种特点含有_，可以通过降解_作为其生长的氮源。 2.培养基用以_为唯一氮源的培养基培养，以_培养基为对照。 3.实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的_培养基进行培养选择。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成_，致使pH升高，使酚红指示剂_。,脲酶,尿素,尿素,LB全营养,选择,NH3,变红,4.实验过程,无菌水,涂布分离,三个,玻璃刮刀,2448,5.反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂_，培养时细菌将尿素分解产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现_。,酚红,红色的环带,1.培
10、养基(1)培养基是指微生物生存的环境和营养物质，一般都含有五大营养要素：即：_、_、_、_、_。一般来讲，“细菌喜 、霉菌喜 ”，大肠杆菌一般采用_培养基，其主要成分为_、_、氯化钠、水等，若要扩大培养，则采用_培养基，若要分离获得纯种，则采用_培养基，这两者的主要区别在于后者加入了_。霉菌培养基一般用_配制成或添加_的豆芽汁。,水,无机盐,碳源,氮源,生长因子,荤,素,LB,蛋白胨,酵母提取物,LB液体,LB固体,琼脂,无机物,蔗糖,(2)种类,琼脂,(3)微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用,2.无菌操作(1)通常在_中进行，超净台使用前_ min，打开_和_，注意打开紫外灯后_
11、，使用时必须关闭_。(2)消毒和灭菌：培养基、培养皿、试管、三角瓶、枪头、接种环、镊子等用具通常用_灭菌，这些用具通常需要用 或报纸包好，其中容器先要用_封口再包好，放入灭菌锅中，在_( 压力)下灭菌_ min。实验用的棉花不能用 ，因 易吸水，吸水后容易引起污染。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用 g/cm2压力( 以上)灭菌 min。由于尿素加热会分解，只能用 过滤除菌，但玻璃砂漏斗使用前也要在 下用纸包好灭菌，用后还需用1 mol/L的 浸泡，并 ，再用 洗至洗出液呈中性， 后保存。将培养基转移到三角瓶和试管中时必须用 ，以免培养基沾到 和 ，发生污染。,超净台,30,紫外
12、灯,过滤风,人必须离开,紫外灯,高压蒸汽,牛皮纸,棉塞或封口膜,121,1 kg/cm2,15,脱脂棉,脱脂棉,500,90,30,G6玻璃砂漏斗,121,HCl,抽滤去酸,蒸馏水,干燥,三角漏斗,三角漏斗,试管口,(3)消毒和灭菌比较,超净台,酒精,所有,芽孢和孢子,灼烧,接种工具,高压蒸汽,培养基,加热灭菌,玻璃砂漏斗,3.微生物接种的两种常用方法比较,接种环,玻璃刮刀,接种环,连续,稀释分散,菌落,无菌水,玻璃刮刀,单个的菌落,不适宜,更易分开,4.菌种保存选用 培养基，于 中保存。用灼烧后的接种环从斜面取菌种时，往往要先使接种环接触 以达到 的目的，然后再取菌体。 5.接种完成后应将培
13、养皿 培养，目的是：防止水蒸气凝结成的水滴落入 冲散菌落，影响单菌落的 。,固体斜面,4 冰箱,培养基,冷却,倒置,培养基,基表面,形成和分离,角度 围绕微生物的利用考查科学实践的能力 1.(2018浙江五校联考)某村庄有一条小溪，近几年由于上游几家乳胶厂不断向其中排放废水，小溪变得不再清澈。某同学想测定该溪水中的细菌含量情况。回答下列问题：(1)先根据所学知识制备LB培养基。制备该培养基的步骤是：计算称量溶化灭菌倒平板，下列关于制备LB培养基的叙述，错误的是_。A.培养基应先调pH再进行灭菌B.培养基应先灭菌再分装到培养皿C.溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦D.灭菌时一般用高压蒸汽灭菌锅在1
14、21 ，500 g/cm2压力下灭菌15分钟,(2)该同学利用上述制备的培养基来检测水样中的细菌数量，他所选择的分离方法应是_；该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_。接种在超净工作台上进行，工作台上实验前一段时间需打开，实验中需关闭的是_(A.酒精灯 B.照明灯 C.紫外线 D.过滤风) (3)值得注意的是，他所选择的这种方法统计的结果往往比实际细菌的数目要低，这是因为_ _ (不考虑实验操作原因引起的细菌数目的变化) (4)该同学欲将所分离出的某种细菌临时保藏，应接种到试管的_培养基上，等菌落长成后，放入冰箱低温保藏。,解析 如果培养基中有葡萄糖，为
15、防止葡萄糖分解碳化，要用500 g/cm2压力(90 以上)灭菌30 min，题中培养基为LB培养基，高压蒸汽灭菌锅在121 ，1 kg/cm2压力下灭菌15分钟；微生物的分离方法有划线分离法和涂布分离法，划线分离法不能计活菌数，涂布分离法只能计活菌数，所以统计的结果往往比实际细菌的数目要低，接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，可以检测灭菌是否彻底；菌种的保存应接种在斜面上，37 培养24 h后，于4 冰箱中保存。 答案 (1)D (2)(稀释)涂布分离法 检查平板灭菌是否彻底 C (3)该方法只能统计样品中活菌的数目，死菌无法统计 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的
16、只是一个菌落 (4)斜面,2.(2018金丽衢十二校联考)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图1所示),(1)图1中，为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以_作为唯一碳源。过程需重复几次，目的是_ _。 (2)某同学尝试过程的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图2所示。该同学的接种方法是_；推测该同学接种时可能的操作失误是_。 (3)上述工程酵母菌培养过程中，有关操作正确的是_。 A.玻璃刮刀用火焰灼烧进行灭菌 B.培养基分装到培养皿后进行灭菌 C.倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行 D.获得
17、的菌种如果需要保存，可置于37 恒温保存,解析 (1)为筛选得到高效利用淀粉的工程酵母菌菌种，固体培养基应以淀粉作为唯一碳源。多次重复筛选是为获得高效利用淀粉的工程酵母菌的纯化菌种。(2)由图2的结果表明，该同学采用的是涂布分离法，其操作的失误是涂布不均匀，造成平板上菌落未均匀分布。(3)涂布操作用的玻璃刮刀通常保存在70%酒精中，使用前引燃酒精，火焰熄灭后待其冷却后使用；培养基通常先灭菌，后趁热倒平板；保存菌种通常使用斜面培养基，在4 冰箱中保存；倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行，这是无菌操作要求。 答案 (1)淀粉 筛选出真正高效利用淀粉的工程酵母菌菌种 (2)涂布分离法 涂布不均匀
18、 (3)C,考点二 浅尝现代生物技术,(2015浙江10月选考节选)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答： (1)取田间矮牵牛的幼嫩叶片，经自来水冲洗，先用70%_浸泡，再用5%次氯酸钠浸泡，最后用_清洗，作为转基因的受体材料。 (2)取出试管苗，在适宜的光照、温度和80%以上的_等条件下进行炼苗。 解析 (1)用作组培的外植体若取自自然环境则需要消毒，方法是外植体经自来水冲洗，先用70%酒精浸泡，再用5%次氯酸钠浸泡，最后用无菌水清洗，才能用于接种。(2)组培时，试管苗需经炼苗才能定植，炼苗时需将试管苗从培养瓶中取出，移栽至具适宜的光照、温
19、度和较高湿度的环境中。 答案 (1)酒精 无菌水 (2)湿度,1.组织培养就是取一部分 ，如根、茎、花瓣、叶或花粉等，在 的条件下接种在三角瓶中的 上，给予一定的 ，使之产生 ，或进而 。组织培养必须在培养基中加入 和 。两者的 决定组织是生根还是生芽。当细胞分裂素与生长素的比例 时，诱导 的生成，两者比例大致 时，愈伤组织继续 ；当细胞分裂素与生长素的比例较 时，会趋于生 。 2.本实验首先用细胞分裂素相对较 和生长素相对较 的 培养基进行培养，获得 ；然后将丛状苗 培养。分株后，再移入含较多 的 培养基中，使其生根；将生根的苗从三角瓶中移至 或 中继续生长；苗健壮后再移至 。,本题组对应选
20、修一P59P61，植物的组织培养,植物组织,无菌,琼脂培养基,光照和温度,愈伤组织,生根发芽,生长素,细胞分裂素,摩尔浓度比,高,芽,相等,生长而不分化,低,根,多,少,发芽,丛状苗,分株,生长素,生根,草炭土,蛭石,土中,1.植物组织培养的原理(1)理论基础：植物细胞具有 。(2)植物组织培养的基本过程,全能性,脱分化,再分化,(3)植物组织培养影响因素 选材：菊花幼苗的茎段，每段至少带有一片叶。 培养基：植物组织培养需要适宜的培养基，常用的是MS培养基，在配制好的培养基中，常常需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。实验中使用的生长素类似物是 ，细胞分裂素类似物是 。 其他条件：pH、温度
21、和光照等条件对植物组织培养也很重要。,萘乙酸（NAA）,苄基腺嘌呤（BA）,2.菊花组织培养过程,高压蒸汽灭菌,消毒,乙醇,次氯酸钠,无菌水,酒精灯火焰,灼烧灭菌,发芽,蔗糖,BANAA,1825,丛状苗,生根,蔗糖,NAA,蛭石,80%,自然湿度,角度 围绕植物组织培养考查科学实践的能力 1.某愈伤组织在如下图甲所示的培养基中培养一段时间后得到如图乙所示的结构，经分析可知该培养基中( ),A.细胞分裂素多，生长素少 B.细胞分裂素少，生长素多 C.细胞分裂素和生长素用量相等 D.只有生长素 解析 从图乙中可知该培养基有利于生根且抑制芽的形成，所以可推断该培养基中生长素多，细胞分裂素少，B正确
22、。 答案 B,2.(2018温州模拟节选)菊花组织培养的部分过程如下图所示：,(1)过程利用_(填“较高”或“较低”)渗透压，使原生质体产量大幅提高，但存活率却因此而降低，分析降低的原因可能是_。过程细胞壁形成后，可逐渐_渗透压。 (2)幼苗带有芽结构，也就有了_组织，所以不通过_阶段就可直接形成丛状苗。过程应在_(从具体功能角度)培养基中进行，全过程对光照要求是_。 A.早期每天24 h光照，后期每天24 h黑暗 B.每天一定时长的光照 C.早期每天24 h黑暗，后期每天24 h光照 D.每天24 h黑暗,解析 植物原生质体的获得方法是：在0.50.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压
23、)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理，外界溶液浓度高于细胞液浓度，细胞失水，形成细胞壁后，应降低渗透压。植物的顶芽具有分生组织，不需要脱分化就可以形成丛状苗，植物组织培养是在无菌条件下，取一部分植物的组织接种在琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽，全过程需要光照。 答案 (1)较高 细胞失水死亡 降低 (2)分生 脱分化 发芽 B,生长素和细胞分裂素用量比例与根、芽的分化,【特别提醒】 1.菊花茎段至少带有一片叶的原因：易区分形态学上端和下端；腋芽处有分生组织，不经过脱分化就可以形成丛状苗。 2.植物组织培养用人工合成的激素类似物而不是天然的植物激素的原因： 植物体内存在使天然激素分解的酶，天然激素的作用和存在时间较短。而植物体内没有使人工合成的激素类似物分解的酶，所以存在时间长，作用效果明显。,
