1、1,口腔微生物研究方法,2,显微镜检查法(Microscope),形态、菌数、菌比,3,光学显微镜 G+、G-球菌 长：宽 1：12：1杆菌 2：16：1丝菌 6：1,4,暗视野显微镜每视野1530个菌为佳，约200个菌螺旋体、活动菌、球菌、杆菌,5,6,扫描电镜，透射电镜超微结构 激光共聚焦显微镜动态观察，三维结构、空间定位,7,8,图1 96h 血链球菌生物膜,9,图2 96h 伴放线放线杆菌生物膜,10,图3 96h血链球菌和伴放线放线杆菌生物膜,11,图4 24h 8种菌株生物膜的三维立体图象,12,图5 96h 8种菌株生物膜,13,图6 96h 8种菌株生物膜的三维立体图象 白色箭
2、头所指处为管道结构,14,细菌培养法(Culture),分类、生物学特性、药敏、深入研究（致病性、毒力因子）,15,采样(sampling)定位，勿污染其他部位 龈上菌斑(致龋菌)需氧或微需氧 饭后23h 采集前漱口，生理盐水冲洗采集区，吸干 控匙刮取 龈下菌斑(致牙周病菌)厌氧或微需氧 采集前漱口，生理盐水冲洗，棉卷隔湿 龈上洁治器去除龈上菌斑 控匙伸入牙周袋底部刮除(带充气导管的采染皿),16,龈沟液(非附着性龈下菌斑) 滤纸吸着法：12mm细长滤纸片 6mm直径圆滤纸片 无菌纸尖 毛细管法 龋沟液测定仪(periotron)电子测定仪 唾液 非刺激性唾液 刺激性唾液,17,18,涂沫(s
3、mear)显微镜下观察（能增培养的菌1/5） 运输(transport),19,分散(dispersion)超声波 30秒钟磁力搅拌器搅拌 1分钟 稀释(dilution)系列10倍稀释菌斑 10-410-10龈沟液、唾液 10-310-8,20,接种(inoculation)、分离(isolation) 培养(incubation)玻棒涂布接种平板划线分离需氧培养：空气微需氧（兼性）培养：95%N2 5%CO2厌氧培养：80% N2 10%CO2 10%H2*操作过程中的无菌观念,21,22,23,24,25,细菌鉴定(Identification),菌落、菌细胞、染色、生化反应,26,27
4、,28,29,刚果红染色法 (Congo red negative staining),原理：酸性染料刚果红将背景染上色，菌体不着色 方法：0.5%刚果红12滴于载玻片上，加同体积菌液，室温风干，1%盐酸冲洗 结果：菌体无色(透明体)，背景蓝色，死菌可被染色,30,BANA法,原理：胰蛋白酶样酶可水解苯甲酰精氨酰奈酰胺(BANA人工合成天然底物) 方法：BANA卡，上方浸Evans黑色染料，下方浸BANA处接种细菌，中线折起，相互接触，35 ，孵育15min 结果：上方染料显色程度阴性:无蓝色 阳性:浅蓝色 强阳性:蓝色,快速检测,牙龈卟啉单胞菌(Pg) 福赛似杆菌(Bf) 齿垢密螺旋体(Td
5、),敏感度 81% 特异性 78% 准确度 80%,31,菌种保存(Storage),不污染、不变异、不死亡,32,细菌毒力的检测方法,33,细菌粘附能力,直径0.5cm玻棒插入菌液 新鲜培养液 洗脱液 分光光度计测OD值,培养24h,34,胞外多糖定性检测 酒精沉淀试验 胞外葡聚糖 TSB5蔗糖+细菌如Sm培养过夜，在室温下放24h 细菌悬液1ml95%乙醇2ml 静置后有沉淀产生即阳性,35,pH测定,牙菌斑、龈沟液、唾液 细菌培养液,36,pH试纸 1-140.5-5.0 锑电极或玻璃电极 每次测定时需用2个标准pH液作校正如pH4.0 pH6.86锑电极或玻璃电极放入6ml溶液中，读数
6、30秒微型玻璃电极或锑电极直接插入牙菌斑中不锈钢超细探头0.8mm,37,鲎试验(limilus test)试管法,原理： 鲎血液的变形细胞含一种凝固酶，经极微量内毒素激活后，使细胞溶解物中的凝固蛋白元转变成凝固蛋白，形成凝胶，凝胶程度与内毒素量有关,38,方法等量鲎试剂与样本混合，置37水浴1小时。 结果阴性(-) 液体流动（无变化或浊度增加）弱阳性(+) 半流动凝胶（具粘性）阳性(+) 倾斜45，凝胶变形，但不流动强阳性(+) 试管倒置，固体凝胶不变形,39,用途检测药物、生物、食品中内毒素污染检测脑脊液、血、尿及体液等内毒素量 优缺点简单易行仅能半定量鲎试剂用量大 注意事项所有器材必须无热源每次试验必须做阴性和阳性对照孵育过程中不得振动,40,41,鲎试验合成基质偶氮显色法,原理： 内毒素激活鲎试剂中的凝固酶，去水解鲎三肽中精氨酸肽链，释放出对硝基苯胺，可与偶氮试剂反应，形成玫瑰红色的偶氮蓝复合物，在545nm处有最大吸收峰，在适当条件下，内毒素浓度与吸光度A值之间有较好的线性关系,42,方法 待测内毒素样本0.1ml+鲎试剂0.05ml，37 25分钟 鲎三肽0.05ml，37 3分钟 冰水终止反应 偶氮试剂（亚硝酸钠、氨基磺酸胺、苯乙二胺） 545nm测吸光度A,43,优缺点 定量检测微量内毒素 灵敏度、特异性、精确度高 需先做内毒素标准品显色的标准曲线或回归方程,
