1、激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81) 简易使用说明书,启动系统 3 显微镜镜下观察微分干涉差观察 4荧光观察 5 取图的操作界面 6 如何取图XY平面单标 7XY平面双标 同步扫描方式 10序列扫描方式 13XY平面 单标 + 微分干涉差 16XYZ扫描双标 19XYL光谱扫描 21 2D 操作界面 24 图像分析打开文件 243D图像的叠加 25比例尺的使用 263D图像的重建 273D图像的旋转 29Unmixing 31保存图像 35 保存到CD-R 36 关闭系统 37 附录 38,内容,1. 打开计算机. 2. 打开激光器. (打开钥匙开关.)
2、2-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON (打开电源开关后,打开钥匙开关.) 2-2. 氦氖绿 (543 nm) ON 2-3. 氦氖红 (633 nm) ON 打开汞灯电源开关. 登陆 Windows XP系统. 双击快捷方式： 打开 FV10-ASW应用软件. * 系统软件的启动需要等待一定时间.,开启系统,5,2,3,1,User ID: Administrator Password: fluoview,User ID: Administrator Password: Administrator, 微分干涉差观察 ,1. 使用手控面板选择物镜. (参照
3、 Memo.) 2. 插入起偏镜. 3. 插入微分干涉滑块. 4. 点击FV10-ASW软件中的图标. 5. 标本聚焦.,Memo 按照7-1的操作转换物镜的倍率之后，对：物镜各物镜对应的DIC元件* 进行操作.,*DIC 元件,1,2,3,4,Note 1. 使用TD滑块控制卤素灯的光强. Note 2. 检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT” .如果不是,用手柄按下DICT图标.,Note 1,显微镜镜下观察,手控面板,用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节., 荧光观察 ,1,2,3,显微镜镜下观察,Hand switch,1. 使用手控面板选择物镜. 2. 点击FV10-ASW软件中的
4、图标. 3. 使用手控面板选择荧光滤色片. (参照 Memo.) 4. 标本聚焦.,Note 2,Notes 1 & 3,Note 1. 选择第3步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议通常机械快门要放在关闭的位置 () .) Note 2. 检查DIC滑块是否拉出.,Memo 关于荧光滤色片NIBA：蓝色激发/绿色荧光（例：FITC、EGFP等） WIG ：绿色激发/红色荧光（例：Rhodamine、DsRed等）,Note 3. 观察之前，检查汞灯的机械快门要放在开启的位置 ().,图像的拇指索引,明场观察 (显微镜镜下观察),荧光观察 (显微镜镜下观察),染
5、料选择,光路图,取图条件的保存,调出取图条件,TwinScanner 设定,取图的操作界面,扫描的按钮选择XYZ,XYT或XYL每个通道的调节 共聚焦的孔径大小卤素灯的光强调节 Kalman方式,图像显示窗口,内存中所显示的文件,扫描模式扫描速度像素数缩放和平移 激光输出的调节,Lambda扫描的设定物镜聚焦时间间隔和时间计数 (用于XYT或XT扫描),扫描带宽选择,获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光染色（FITC）,点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 .同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染
6、料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2. 3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),1,2,3,染料选择后的显示界面,如何取图 (XY平面-单标),Memo 扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描),4,5,6,如何取图 (XY平面-单标),4. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 5. 调节绿色(FITC)图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.) 6. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),7,8,9,10,如何取图 (XY平面-单标),7. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描
7、速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8. 点击XY按钮取得一幅图像. 9. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 10. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF
8、格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色 同步扫描,如何取图 (XY平面-双标),点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 .同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2. 3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),染料选择后的显示界面,4,5,6,如何取图 (XY平面-双标),Memo 扫描控制面板:
9、 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描),4. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 5. 调节绿色(Alexa Fluor 488)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.) 6. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),7,8,9,10,如何取图 (XY平面-双标),7. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 8. 点击XY按钮取得一幅图像. 9. 点击Seri
10、esDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 10. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,获取单张图像（XY平面）（荧光图像） 例：绿色荧光（ Alexa 488 ）红色荧光（ Alexa 546 ）二重染色 序列扫描 (这里
11、介绍线序列扫描.),如何取图 (XY平面-双标),点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 .同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2. 3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.),染料选择后的显示界面,4,5,6,7,如何取图 (XY平面-双标),4. 点击序列扫描,并选择线序列方式. 5. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 6. 调节绿色(Alexa Fluor 488)图像和红色 (Alexa Fluor 546)图像. (图
12、像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.) 7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),8,9,10,11,如何取图 (XY平面-双标),8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 9. 点击XY按钮取得一幅图像. 10. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 11. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 F
13、V10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,4,获取单张图像（XY平面） （荧光图像微分干涉） 例：绿色荧光（FITC）+DIC图像,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 .同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已
14、指定的荧光染料，并重复步骤2. 3. 点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.)4. 选择TD1.,染料选择后的显示界面,5,6,7,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),Memo 扫描控制面板: 连续扫描: 停止扫描: 快速扫描(隔行扫描),5. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 6. 调节绿色 (FITC)图像和微分干涉差的图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1.) 7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo.),8,9,10,11,如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差),8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢
15、, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 9. 点击XY按钮取得一幅图像. 10. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 11. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的
16、文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,4,5,8,Memo和 按钮: 点击移动1.0m.: 点击移动0.1m.,2,6,7, 获取3D图像(XYZ) (荧光图像) 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光 (Rhodamine)双标 这里介绍线序列扫描取图的过程.,如何取图 (XYZ扫描-双标),1. 采用13和14页步骤1到7. 2. 输入StepSize大小(点击OP按钮可以使用推荐的值), 并选择 . 3. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 4. 点击 和 按钮上移焦点位置. (参照Memo.) 5. 当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定. 6. 点击 和 按钮下移焦点位置
17、. (参照Memo.) 7. 当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定. 8. 点击Stop按钮停止扫描.,确定Z轴的上限和下限如下.,9,10,11,13,12,如何取图 (XYZ扫描-双标),9. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 10. 选择Depth按钮. 11. 点击XYZ按钮取得图像. 12. 点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 13. 保存该幅图像: 右击图像管理
18、器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,2,3,*可以通过调用扫描状态来实现该设置. 更多的信息, 参照附录5., 获取光谱图像 (XYL) 例: 绿色荧光(Alexa Fluor 488)和 绿色荧光 (YOYO-1)双标,如何取图 (XYL光谱扫描),1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯
19、快门 .同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2. 点击按钮 检查光路. 3. 做如下设置.,选择 BS20/80 或 DM405/488.,选择488nm作为激发光源.,选择 Mirror.,只选择CHS1.,4,5,6,7,9,如何取图 (XYL光谱扫描),4. 点击按钮 , 出现光谱设置窗口. 5. 设置CHS1光谱带宽为10 nm, 以此 为例. (参照附录4关于改变光谱带宽的方法.) 6. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 7. 在观察图像的同时, 移动光谱带到图像最亮的位置状态. (参照附录4关于改变光谱带宽的方法.)注: 移动光谱带位置要保持光谱 带宽为10 nm不变. 8.
20、调节图像. (参照附录1.) 9. 点击Stop按钮停止扫描.,10,11,12,13,15,14,如何取图 (XYL光谱扫描),10. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2.) 11. 设定要扫描的波长范围, 光谱带宽 和步距. Start = 开始波长 End = 结束波长 Resolution = 光谱带宽 StepSize = 步距 12. 选择Lambda按钮. 13. 点击XYL按钮取得图像. 14. 点击SeriesDone按钮, “
21、2D View-LiveImage(x)” 2D界面就出现. 15. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像 (保存为“oib” 和“oif“类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),1. 双击资源管理器中要选择打开的文件.,1,图像分析(打开文件),2D的操作界面,1,2,图像分析 (3D图像的叠加),1. 点击按钮 并选择 .,2. 要保存此图像, 右击此图像, 选择Save Display并命名.,1,2,3,4,5,图像分析 (比例尺的使用),1. 点击按钮 . 2. 点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个特定的位置. 3. 点击手柄的左端或右端,
22、移动鼠标. 4. 选择比例尺并右击选择属性的设置. 5. 设置具体的比例尺属性.,改变比例尺的大小,改变文本, 颜色, 字体等.,以一定的角度观察3D图像,观察3D图像的某个横截面,1,3,4,5,图像分析 (3D图像的重建),1. 点击按钮 . 2. 创建3D图像. 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作.,4. 点击按钮 并选定 . 5. 拖动鼠标观察某个垂直横断面. 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作.,保存上一页中第3、5选项的图像,6,8,图像分析 (3D图像的重建),6. 点击按钮 . 7. 会创建一个2D图像 (带文件名). 8. 保
23、存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式.),Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF)的图像” 和 “一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作.,1,3,动画的播放,4,图像分析 (3D图像的旋转),1. 点击按钮 . 2. 创建3D图像. 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像.,4. 点击并控制按钮 实现图像围绕着 X-轴旋转. 再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Y-轴
24、旋转. 再次点击停止旋转.点击并控制按钮 实现图像围绕着 Z-轴旋转. 再次点击停止旋转.,5,7,10,6,8,9,图像分析 (3D图像的旋转),5. 点击按钮 . 6. 点击Angle rotation菜单. 7. 选择旋转轴. 8. 输入旋转的角度. 9. 选择AVI类型并点击Create按钮. 10. 输入一个文件名并点击Save按钮.,Start = 开始角度 End = 结束角度 Frame/s = 旋转速度 Interval = 单次旋转的角度,2,3,4,图像分析 (Unmixing) I. 每种荧光染料的定位都很明显的情形,基于XYL图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的
25、每种荧光染料的定位分解光谱并得到图像.,例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和 绿色荧光 (YOYO-1)双标,5,6,Unmixed image,1. 打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像. 2. 分别为 Alexa Fluor 488和 YOYO1选定一个封闭的区域. 3. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标. 4. 双击ROI1和ROI2区域. 5. 检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮. 6. 获得图像.,2,3,4,5,6,记载的荧光光谱在此显示.,图像分析 (
26、Unmixing) II. 基于使用单标样品作参照的情形,从单标记的XYL图像中取出单个荧光光谱作为参照, 进行光谱的分解并得到图像.,例:绿色荧光(Alexa Fluor 488)和 绿色荧光 (YOYO-1)双标,1. 打开一幅 Alexa Fluor 488单标取样 的XYL图像. 2. 为 Alexa Fluor 488选定一个封闭的 区域. 3. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标. 4. 双击ROI1区域. 5. 点击Save Profile图标. 6. 输入保存的名字并且点击OK按钮将 Alexa Fluor 488的光谱记载到
27、数据库中. 7. 对于YOYO1单标, 重复1-6步.,Unmixed image,9,10,11,12,8,图像分析 (Unmixing) II. 基于使用单标样品作参照的情形,8. 打开一幅 Alexa Fluor 488和 YOYO1双标的XYL图像. 9. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标. 10. 双击数据库中记载的 Alexa Fluor 488 和 YOYO1图标. 11. 检查处理类型设置为 “Normal”并且 点击Execute按钮. 12. 获得图像.,2,3,4,5,图像分析 (Unmixing) III. 基于只知
28、道一定数量标记的荧光染料的情形 (Blind Unmixing),基于XYL图像中类似荧光光谱相连的原则, 通过已知的一定数量的荧光标记分解光谱并得到图像.,例: 两种类型荧光标记的样品,Unmixed image,1. 打开一幅具有两种类型荧光标记的XYL图像. 2. 从Processing下拉菜单中选择 Spectral Deconvolution图标. 3. 选中两个检查框用于计算. (具有三种类型荧光标记时要选中 三个检查框.) 4. 检查处理类型设置为 “Blind”并且 点击Execute按钮. 5. 获得图像.,XY或者XYZ图像的每个通道存为 TIFF格式的文件,1. 右击图像
29、管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像 2. 设置Save as类型为 TIFF并保存. * 存为BMP 和 JPEG格式也可以.,1,2,3,1,2,图像分析 (保存图像),*,XY或者XYZ通道合并的图像存为 TIFF格式的文件,带有比例尺的图像存为BMP格式的文件,1. 右击图像管理器中显示的图像图标, 选择另存为保存该幅图像 2. 设置Save as类型为 TIFF并保存. 3. 检查要合并的通道并保存. * 存为BMP 和 JPEG格式也可以.,1. 右击该幅图像. 2. 选择Save Display并以新的文件名 保存该幅图像.,动态图像存为AVI格式的文件,1. 右击该
30、图像. 2. 选择Save as AVI并以新的文件名 保存该图像.,保存到 CD-R,2,3,4,5,7,6,1. 插入一张CD-R光盘. 2. 点击OK. 3. 选择文件并拖放到CD-R的窗口. 4. 点击“Write these files to CD.“ 5. 点击Next. 6. 开始刻录. 7. 点击Finish按钮结束.,1,3,4,关闭系统,2,1. 选择File/Exit, 退出FV10-ASW软件. 2. 退出Windows XP. (1) 选择Start/Shut Down. (2) 在Shut Down窗口中, 选择Shut Down并点击OK按钮. 3. 关闭激光器.
31、 (关闭钥匙开关.) 3-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) OFF(等待风扇停止,关闭电源开关.) 3-2. 氦氖绿 (543 nm) OFF 3-3. 氦氖红 (633 nm) OFF4. 关闭汞灯电源.,激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81) 附录, 共聚焦的原理和调节原理,附录1,HV: 探测器灵敏度的调节 (Voltage) 给定值 灵敏度 图像亮度 (注意背景噪音变得突出.)* 推荐值为700V或700V以下.按钮: 改变电压以1V为一个单位 (投射光通道设定为1V) Gain调节 (x) 给定值 图像亮度 依照放
32、大率的变化, 图像变得更亮.按钮: 改变增益以x 0.01为一个单位 Offset调节 (%) 给定值 图像亮度 按钮: 改变增益补偿以1%为一个单位,C.A.: 共聚焦孔径大小的调节 (m) 给定值 C.A. 大小 图像亮度 (注意光学切片的厚度变大.)* 推荐使用Auto设置. 经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto.按钮: 改变孔径大小以1m为一个单位.,M_Ar or HeNeG, HeNeR: 激光输出强度的调节 (%) 给定值 输出强度 图像亮度 (注意荧光漂白变得明显.)* 激光输出强度尽量要小.按钮: 改变输出强度以1%为一个单位., 获取图像如何降低背景噪音 ,降低扫描速度,通过降低扫描速度探测器从开始检测就 忽略背景噪音. 优点: 相比Kalman方式, 能够取到更锐的图. 缺点: 单次扫描的速度很慢.,1. 选择扫描速度.,附录2,*,Auto ON: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度不变. Auto OFF: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度增加.,Kalman方式,通过重复获取一定数量的图像进行平均算法运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度. 优点: 单次扫描的速度很快. 缺点: 由于图像平均而图像模糊.,1. 点击Kalman并选择Line或Frame方式. 2. 输入累计数字(扫描的次数).,
