1、第三章 核 酸化学(Nucleic Acid Chemistry),第一节 核酸的重要性 (Importantance of Nucleic Acids)What are nucleic acids? Nucleic acids are a kind of very important biomacromolecule.They exist in all organism (including virus).,They play very important role during organism living activate such as:growth developmentrepro
2、ducingheredity variation.So it can also say that there is no life without nucleic Acids.,核酸化学研究史： （1） 1869年Miescher, 博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时, 发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物, 并在所有细胞的核里都找到了此物质, 故命名“核质(Nuclein)”,即今天我们所说的脱氧核糖核蛋白，其中脱氧核糖核酸的含量为30%。,（2） 1889 年Altman等人又从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的核酸，并建议将“ 核质”改名为“ 核酸”, 因为已经认识到“ 核质” 乃“
3、 核酸” 与蛋白质的复合体。 （3）1944年,O.T.Avery 等人通过细菌转化实验证明核酸是遗传物质。 目前，核酸的的研究已成为生物学研究中最活跃的一个领域，是最重要的生物大分子。,第二节 核酸的分类及其在细胞内的分布 （Classification and distribution of nucleic acid）一、核酸的分类 Nucleic acids are grouped into two types nucleic acid ：,（一） 脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid , DNA) （二） 核糖核酸（ribonucleic acid , RNA)
4、1、转移RNA（transfer RNA , tRNA) 2、核糖体RNA（ribosomal RNA , rRNA) 3、信使RNA（mesenger RNA , mRNA),4、特殊功能的RNA: Small nuclear RNA , snRNA Small nucleoar RNA , snoRNA Small cytoplasmic RNA , scRNA Antisense RNA Ribozyme RNase P,二、核酸的分布In eukaryotes，DNA mainly exist in nucleus（more than 98%）； mitochondria and ch
5、loroplasts respectively have their own DNA.In prokaryotes，DNA exist in nucleoid（拟核区）. Every prokaryotic cell only contain one chromsome（染色质），which is double-strand circular DNA molecule.,In addition，It also contain plasmid DNA（质粒DNA ）Viruses consit nucleic acid（DNA or RNA）coated with protein（called
6、capsid，病毒衣壳）.RNA mainly exist in the cytosol（90%），the other 10% in nucleus.,三、核酸的功能（一）DNA是主要的遗传物质1944 ， O. Avery 肺炎双球菌转化实验1952 ， A.D Hershey 和M. Chase 噬菌体感染实验,（二）RNA功能的多样性1、参与蛋白质的合成 2、RNA的转录后加工与修饰 3、参与基因表达的调控 4、生物催化作用,第三节 核酸的结构,一、核酸的化学组成,两类核酸的基本化学组成RNA： D-核糖， A、G、C、U碱基 DNA： D-2-脱氧核糖， A、G、C、T碱基,（一） 碱
7、基 1.嘧啶碱：尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶2. 嘌呤碱： 腺嘌呤 鸟嘌呤 嘌呤衍生物 ：3. 核酸中的修饰碱基： 100余种，多数是甲基化的产物,Structure of T and C,Structure of A and G,（二） 核苷与脱氧核苷,嘧啶碱： C1 N1，嘌呤碱： C1 N9。 核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型 碱基平面与核糖平面互相垂直,2、核酸中的稀有核苷 稀有碱基 稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（）P481 甲基化核糖,（三） 核苷酸核苷中戊糖C2 、C3、C5羟基被磷酸酯化,1. Bases, Nucleosides, and Nucleotides,Cytosine, Cy
8、tidine, Cytidine monophosphate CMP Uracil, Uridine, Uridine monophosphate UMPThymine, Thymidine, Thymidine monophosphate AMPAdenine, Adenosine, Adenosine monophosphate AMPGuanine, Guanosine, Guanosine monophosphate GMP,2、 细胞内的游离核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸 3,5-cAMP， 3,5-cG
9、MP 信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。,二、 DNA的结构,一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢 键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,（一） DNA的一级结构蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸P482 图13-1磷酸二酯酶对核酸的水解作用DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。P483 图 13-2DNA中多核苷酸的一个片段及缩写符号,写法：53： 5-pApCpTpG-3，或 5AC
10、TG3,（二） DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。,Photo by A.C. Barrington Brown, courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.,1962 Francis Crick, James Watson, and Maurice Wilkins receive the Nobel Prize for determining the molecular structure of DNA.,Chargaff 规
11、律 1950年所有生物的DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。b. DNA的碱基组成具有种的特异性。c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。,Structure of DNA Double Helix,1、 Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)（1）DNA分子为两条多核苷酸链以相同的螺旋轴为中心，盘绕成右旋、反向平行的双螺旋.（2）磷酸和戊糖组成的骨架位于螺旋外侧，碱基 位于螺旋内侧，并且按照碱基互补的原则，碱基之间通过氢键形成碱基对，A-T间形成二个氢键、G-C间形成三个氢键.（3）双螺旋的直径是2nm，每10
12、个碱基对旋转一周，螺距为3.4nm，所有的碱基平面都与中心轴垂直.（4）维持双螺旋的力是碱基堆积力和氢键.,3.4nm,（1.2nm, 0.85 nm）,（0.6nm, 0.75 nm）,Double helix Right-handed 10 base pairs/turn 3.4 nm /turn Diameter: ca. 2.0 nm, 磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。,磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。,碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行, 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。,螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力
13、维持, 每圈螺旋10.4nt ，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm， 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm,2、稳定双螺旋结构的因素 碱基堆积力形成疏水环境（主要因素） 。 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,3、 DNA二级结构的多型性 P489表13-6 A-、B-、Z-DNA的比较相对湿度92%：BDNA 相对湿度75%：ADNA。,（1） BDNA：典型的
14、Watson-Crick双螺旋DNA 右手双螺旋 每圈螺旋10.4个碱基对 螺距：3.32nm （2） A-DNA 右手双螺旋，外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 （3）Z-DNA 左手螺旋，外形细长。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,（4） 三股螺旋DNA K. Hoogsteen 1963,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合： oligo(Py) : oligo(Pu)oligo(Py/Pu),第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤,T= A : A , CG ： C+ T = A : T CG
15、： G,第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对,DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。,(三） DNA的三级结构DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象 超螺旋是DNA三级结构的主要形式,1、 环状DNA的三种典型构象 P491 图13-12,（1）、 松弛环形DNA 线形DNA直接环化 （2）、 解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化 （3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA,2、 三种环形DNA的拓扑学特性,连环数（linking num
16、ber , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W）,L=T+W,负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等,3、真核生物染色体的结构染色质、染色体常染色质、异染色质永久性异染色质、功能性异染色质核小体（nucleosome):146bp,组蛋白：H2A、H2B、H3、H4P495 图13-17真核生物染色体DNA的组装层次,MOV：MCB4.0three di
17、mensional packing of nuclear chromosomes,三、 RNA的结构,（一） RNA的一级结构 P483AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。, 组成RNA的戊糖是核糖 RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。,Transfer RNA,Small polynucleotide chains - 73 to 94 residues each Several bases usually methylatedmethylated Each a.a. h
18、as at least one unique tRNA which carries the a.a. to the ribosome 3-terminal sequence is always CCA-a.a. Aminoacyl tRNA molecules are the substrates of protein synthesis,假尿嘧啶核苷,二氢尿嘧啶核苷,胸腺嘧啶核糖核苷,4-硫尿核苷,次黄嘌呤核苷,1-甲基鸟苷,N-6-异戊烷腺苷,二级结构： 三叶草型氨基酸臂 二氢尿嘧啶环 反密码环 额外环 TC环（假尿嘧啶环）三级结构： 倒L形（酵母 tRNAphe),tRNA的功能： 转运
19、氨基酸 识别密码子 参与翻译起始 参与DNA的反转录 参与基因表达调控,（三） mRNA的结构,原核：多顺反子（polycistronic mRNA) 真核：单顺反子，断裂基因（splited gene),Eukaryotic mRNA,DNA is transcribed to produce heterogeneous nuclear RNA （hnRNA核内不均一RNA） mixed introns and exons with poly A intron - intervening sequence exon - coding sequence poly A tail - stabil
20、ity? Splicing produces final mRNA without introns,5-帽子：m7G 5 -ppp5-Nm（ Nm ）p-,O型： m7G 5 -ppp5-Np- I： m7G 5 -ppp5-Nmp-Np- II: m7G 5 -ppp5-Nmp -Nmp -Np-,（四） rRNA的结构细菌： 16S rRNA 、5S rRNA、23S rRNA组成30S转录单位真核：18SrRNA、 5.8S rRNA，28S rRNA组成45S的转录单位，5S rRNA单独转录。,Ribosomes are about 2/3 RNA, 1/3 protein rRNA
21、 serves as a scaffold for ribosomal proteins 23S rRNA in E. coli is the peptidyl transferase!,大肠杆菌 5S rRNA 结构,P498 图13-20 16S、5S rRNA的结构,rRNA的功能： 组成核糖体 催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上 参与tRNA与mRNA的结合,第三节 核酸的物理化学性质,一、核酸的水解 （一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键利用酸水解可以研究核酸的碱基组成,（二） 碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.31mol/L KOH，24
22、h，可将RNA完全水解。DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,（三） 酶水解非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶,1、核酸酶的分类底物专一性： 核糖核酸酶 RNase脱氧核糖核酸酶 DNase作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式： 5-（寡）核苷酸 3-（寡）核苷酸,2、RNAase RNase H 作用于DNA-RNA中
23、的RNA链牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高RNase T2 产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸,3、DNase核酸酶S1 作用于单链DNA部分牛胰核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA 产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸,5、DNA限制性内切酶(Restriction Enzymes)在细菌中发现，主要降解外源DNA。具有严格的碱基序列专一性,Bacteria have learn
24、ed to “restrict“ the possibility of attack from foreign DNA by means of “restriction enzymes“ Type II and III restriction enzymes cleave DNA chains at selected sites Enzymes may recognize 4, 6 or more bases in selecting sites for cleavage An enzyme that recognizes a 6-base sequence is a “six-cutter“
25、,二、 核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 44.5 RNA 等电点 22.5,三、 核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收， max=260nm,1、 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、 含量计算A值为1相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸,四、 核酸的变性、复性及杂交 (Denaturation、Renaturation
26、 and Hybridization),(一) DNA 变性(Denaturation of DNA),核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,Denaturation of DNA,Double-stranded DNA,A-T rich regionsdenature first,Cooperative unwindingof the DNA strands,Strand separation and formation of single-strandedrandom coils,Extremes in pH orhigh temperature,变性因素 ： 热变性 酸碱
27、变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 变性后的理化性质 ： 260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。,增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,1、 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在8295之间,2、 影响DNA的Tm值的因素,DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。,G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C
28、含量。 G-C%=（Tm-69.3）2.44,介质中离子强度 离子强度高，Tm高。,(二) 复性 (Renaturation),变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。,DNA reassociation (renaturation),Double-stranded DNA,Denatured, single-stranded DNA,Slower, rate-limiting, second-order process of finding complementary sequences to nucleate base-pairing,Faster, z
29、ippering reaction to form long molecules of double- stranded DNA,热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。,P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。,Cot1/2表示复性一半的Cot值。,根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数,(三),核酸的杂交,双链DNA,单链DNA,杂交,在DNA复性过程中,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间,也可以发生在碱
30、基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间 ,这种现象称为分子杂交。,核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。,第四节 核酸研究技术,一、 核酸的分离纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。,（三）核酸的定量 P514紫外分光光度法硫酸 钼酸 还原剂 定磷法 有机磷 P 磷钼酸 钼蓝盐酸 苔黑酚 定糖法 RNA 糠醛 鲜绿色物盐酸 定糖法 DNA 蓝色物二苯胺,二、核酸
31、的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。,（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度 0 ：为标准DNA的密度 ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离,（二）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.65
32、8 xG-C = （ -1.658） 10但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。,（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象RNADNA变性DNA双链DNA 蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大,（四）密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象 的DNA,超螺旋DNA或,三、 核酸的凝胶电泳,（一） 琼脂糖电泳,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广,影响迁移率的因素： 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/ml EBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛,琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定,琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化,（二） PAGE电泳用于小片段DNA的分析，精度非常高,六、DNA聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction PCR,PCR是以DNA聚合酶在体外扩增DNA片断技术，经历DNA变性、退火、聚合酶催化DNA链的延伸等三个步骤周而复始的过程。,1993Dr. Kary Mullis discovered the PCR procedure, for which he was awarded the Nobel prize.,
