1、第四章 发酵工程的灭菌 和空气除菌,在当前的发酵工业中，绝大多数的发酵过程属于需氧的纯种发酵。 发酵过程中需要不断通入无菌空气以满足微生物生长及合成代谢产物的需要。 在整个发酵系统内存活的生物体只有需要培养的微生物，如果在发酵系统内除了需要培养的微生物以外，还有其他微生物存活，这种现象称为染菌。 染菌会给发酵带来很多负面影响，轻则影响产物的产量，或使产物的提取变得困难，造成产品质量下降或收率降低，重则导致产物全部损失，所以染菌是工业发酵的“大敌”。 发酵使用的培养基、发酵设备、空气过滤器、附属设备、管路、阀门以及通入罐内的空气，在使用前均需彻底灭菌或除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关
2、键。,本章内容,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,在工业发酵中，发生杂菌污染会产生以下不良后果： 营养物质和产物会被杂菌消耗而损失； 杂菌产生的毒性物质和某些酶类会抑制生产菌株的生长； 杂菌的代谢产物改变发酵液的某些理化性质(如溶解氧、黏度、pH) ，抑制产物的生物合成； 污染的杂菌和产生的某些酶类会分解或破坏已经合成的产物； 使产物提取变得困难，造成产率降低或使产品外观及内在质量下降； 发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。,因此防止染菌是任何发酵的一项重要工作内容，必须牢固树立无菌观念，特别强调无菌操作： 发酵设备、空气过滤器、附属设备、管
3、路、阀门应严格密闭，整个系统要维持高于环境的压力，使用前应经过彻底灭菌； 培养基和培养过程中加入的物料应经过彻底灭菌； 通入罐内的空气应经彻底除菌处理； 使用无污染的种子等。 这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,一、常用灭菌方法,第一节 灭菌和除菌的基本原理,灭菌：是利用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。 消毒：是采用较温和的理化方法，仅杀死对人体有害的病原微生物的过程。 消毒只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢或孢子。 除菌：是指用过滤方法除去空气或液体中所有的微生物及其孢
4、子。,防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如： 低温，缺氧，干燥，高渗，高酸度，防腐剂。 化疗即化学治疗：是利用具有高度选择毒力（即对病原微生物具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。,发酵工业生产中常用的灭菌方法： 化学物质灭菌、 热灭菌 辐射灭菌 过滤介质除菌 臭氧（O3）灭菌,干热灭菌 湿热灭菌,高温灭菌,干热灭菌法,火焰灼烧法 热空气灭菌法,湿热灭菌法,常压灭菌
5、,高压灭菌,巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法,高压12120min； 低压10530min。,低温长时间(LTLT,6265,30分钟)，现在殆不存在， 高温短时间(HTST,7275,15秒)，能杀灭牛乳中之所有病原菌，在欧美主要被使用。 超高温加热瞬时法(UHT法 ，135150、26秒) ，而成为今日牛乳杀菌法的主流，此有牛乳中乳清蛋白增进变性之虞。 达到杀菌与保质，缩短时间，提高经济效益。,二、工业生产中的灭菌 1、工业上具体措施包括 （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过
6、灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。 2、培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。 3、培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,1、化学物质灭菌 原理：某些化学药剂能与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜透性而具有杀菌或消毒的作用。 常用的化学药剂：甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、苯酚、季氨盐(如新洁尔灭)、氯化汞等。 适用情况：因
7、培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应，同时药物加入培养基之后很难除掉。适合于局部空间或某些器具的消毒，但不适合用于培养基的灭菌。 使用方法：根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,第一节 常用的灭菌方法,2、臭氧（O3）灭菌 臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。原理是： 臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有极强的氧化作用，能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死； 直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受阻，导致细菌死亡； 作用于细
8、胞外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。,我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧灭菌有许多特点：O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分布均匀。 臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相当，高于其它消毒剂。 杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等， 并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。 臭氧制备是利用我们周围的大气制取(现有成型产品：臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料储储所需的占地面积。,臭氧分解形成的单个氧原子（O）则会自行重新结合成为普通氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，没有二次污
9、染，故称无污染消毒剂(绿色消毒剂)。 臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。 对管道容器的灭菌； 与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净区的灭菌； 对原辅助材料和工作器具的灭菌； 对密闭空间的灭菌； 对药厂用水的灭菌处理。,3、辐射灭菌 辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。 X射线、射线，波长0.11.4，含有极高的能量，使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧化物，如HO2 、H2O2，使细胞内某些蛋白质和酶发生
10、变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速死亡。 X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射，不适于发酵生产使用。,紫外线波长为21003100的紫外线有灭菌作用，最常用的波长2537的紫外线。 主要是与菌体核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。 紫外线对微生物菌体和芽胞均有杀灭作用，有高度致死效果。但紫外线的穿透力很低，仅适用于表面和局部空间灭菌，如台面、洁净室、更衣室等。 现在，紫外线常与HVAC相结合用于气相循环消毒。 HVAC是Heating, Ventilation and Air Conditioning 的英文缩写，就是空气调节系统，是包含温度、湿度、空气清净度以及空气循环
11、的控制系统。,4、静电除菌 静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。原理是，悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压(1000V/cm2)静电场时都会被电离成带电颗粒，受静电场库仑力的作用，向极板移动，吸附在极板上，得到净化的气体排出除尘器外。,空气进,空气出,钢丝电晕电极,钢管沉淀电极,+,+,优点：阻力小，约0.01MPa； 除水、除油的效果好 耗电少，每处理1000m3的空气每小时仅耗电0.20.8KW。 缺点： 静电除菌效果不是很高，一般在8599%之间； 当捕集的微粒积聚到一定厚度时，极板电压下降，微粒的吸附力减弱甚至随气流飞散，这
12、时除菌效率很快下降。一般当电极板上尘厚1mm时，就应该用喷水管自动喷水清洗，洗净干燥后重新投入使用。 对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。 设备庞大 、一次性投资较高。,由于除菌效率不高，往往需要与高效空气过滤器联合用于洁净工作室空气除菌；或用于洁净工作台。,5、介质过滤除菌 要去除液体或气体中的微生物以达到无菌要求，可以使用适当的材料进行过滤，这种方法只能用于澄清流体的除菌。工业上主要用于热敏性物质(氨水、丙醇等)和空气的除菌。按过滤除菌机制不同而分为两者原理是不同的，绝对过
13、滤介质间的空隙小于颗粒直径，是靠表面拦截作用除去菌体；而深层过滤介质间的空隙远大于颗粒直径。是靠微生物微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降及静电吸附等作用，将其中的尘埃和微生物截留、捕集在介质层内，达到过滤除菌体目的。,绝对过滤 深层过滤,6、物理法 干热灭菌法 ：灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品在干热灭菌器中，于160下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170。 射线灭菌法：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法，波长范围在200275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用最强的范围是250 270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。
14、在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 5min，芽孢约10min即可杀灭。但其穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。 过滤除菌：使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，出去微生物的方法。主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。,湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使生物大分子化学键受到破坏。常用于培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。 煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸15-20m
15、in，一般微生物细胞可杀死，但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60 10min，芽孢用100 10min，嗜热细菌用120 20-30min可完全杀死。 巴氏消毒法：有的食物经煮沸或用更高的温度处理会损害它的营养价值或色香味，则采用巴氏消毒，已达消毒和防腐目的。60-62 30min或70 15min，以杀死其中的病原菌或部分微生物的营养体。适用于牛奶、啤酒、黄酒酱油、醋等食品。 间歇灭菌法：反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。100 30-60min而杀死微生物营养体，置37 培养1h，使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适用于不能高压
16、灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基等。 高压蒸汽灭菌：使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1兆帕（MPa，一公斤的压力），121 15-30min，可杀死各种微生物及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。,湿热灭菌原理,灭菌不利方面,由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失,第二节 培养基与发酵设备的灭菌,一、灭菌的机理 （一）化学灭菌机理：化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）
17、与微生物细胞中的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、核算的破坏、酶的失活、细胞膜头型的改变而杀死微生物。 （二）紫外线灭菌机理：在紫外线照射下微生物细胞的DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA的复制。此外，空气在紫外线照射下生成的臭氧也有一定的杀菌作用。 （三）干热灭菌机理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。,1、湿热灭菌中的相关定义,致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。 对于同种微生物，在致死温度范围，温度愈高，致死时间就愈短，二者呈反比。 同种微生物的营养体、芽孢和胞子的结构不同，对热的抵抗
18、力也不同，致死温度和致死时间也有很大的差别。 不同的微生物的致死温度和致死时间也有差别。 一般无芽孢的营养菌体在60保温l0min即可全部被杀死， 而芽孢在100%下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死， 某些嗜热细菌在121下可耐受20-30min 。,微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示。 热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。 一般来说，灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。 相对热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。,某些微生物的相对热阻及对一些灭菌剂的相对抵抗力 (与大肠杆菌相比较),2、湿热灭菌的优点蒸
19、汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。3、湿热灭菌的机理每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。 微生物受热死亡的原因主要是高温使微生物体内的一些重要蛋白质发生凝固、变性，而致使微生物。,4、培养基湿热灭菌需解决的工程问题 1）将培养基中的杂菌总数N0 杀灭到可以接受的总数Nt（10-3）需要多高的温度、多长的时间为合理。 2）灭菌温度
20、和时间的确定取决于： （1）杂菌孢子的热灭死动力学 （2）反应器的形式和操作方式 （3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围 5、生物热死动力学（对数残存定律）,对数残留定律：在一定温度下，微生物受热死亡的速率与任何瞬间残留的活菌数成正比。,对数残留定律 的意义： 热灭菌时间(t)取决于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌数Nt)以及热致死速率常数k值。 因此配制培养基所用原料要含杂菌少，培养基配制后要尽快灭菌，以减少杂菌的生长。 灭菌程度的确定：在对数残留方程式中，如果要达到绝对彻底地灭菌，即Nt=0，所需灭菌时间t为，这实际上是不可行的。 因此在生产设计上常采用Nt=0.001 为达到灭菌要
21、求，即，在1000批次灭菌中只允许有1批失败； N0可以参考一般培养基中的活菌数，取为1107 2107个/mL。由此得到的是理论灭菌时间，实际设计和操作时可适当延长或缩灭菌时间。,K 与菌种的特性有关 相同温度下，微生物越耐热，k值越小。 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。,6、反应速率常数K,K 与灭菌温度有关 若温度升高，残留曲线会变陡，也就是k值增加，表明微生物灭菌时容易死亡。,某嗜热芽胞杆菌在104 和131 时的残存曲线,k值是微生物耐热性的特征，与微生物的种类和灭菌温度有关。灭菌速度常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。 在相同的灭菌条件下，各种微生物的k值是不同的，
22、k值愈小，表明这种微生物的热阻愈大，越耐热。 细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱，如121 时， k =101010/min 。 而细菌芽孢、霉菌孢子对热的抵抗力较强。如121 时，k =1/min左右，,7、杀灭细菌芽孢的温度和时间成熟的细菌芽孢除含有大量的钙-吡啶二羧酸成分外，还处于脱水状态，成熟芽孢的核心只含有营养细胞水分的10%30%。这些特性大大增加了芽孢的抗热和抵抗化学物质的能力。在相同温度下杀灭不同细菌芽孢所需时间不同，一方面因为不同细菌芽孢对热的耐受性不同，另外培养条件的不同也使耐热性产生差别。,表 多数细菌芽孢的灭菌温度与时间,下表列出的是达到完全灭菌(
23、以杀灭细菌芽孢为准)的灭菌温度、时间和营养成分维生素B1破坏量的比较，可以清楚地说明这一问题。,温度和时间对培养基灭菌的影响,因此，选择既能达到灭菌要求又能减少营养成分破坏的灭菌温度和时间，是提高培养基灭菌质量的重要内容。 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数Nt(10-3)， 需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于： （1）杂菌孢子的热灭死动力学； （2）反应器的形式和操作方式； （3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围。,首先，培养基的绝大部分营养成分的破坏属于一级分解反应，其反应动力学方程式为：式中：C-反应物浓度(mol/L)；t-分解反应时间(s)；k
24、-分解反应速度常数，与温度和反应物种类有关(1/s) 化学反应中，在其他条件不变的情况下，分解反应速度常数k与温度T的关系用阿累尼乌斯方程式表示：式中：A-分解反应的阿累尼乌斯常数(1/s ) R-气体常数8.314J/(mol K)；T-热力学绝对温度(K)；E-分解反应所需的活化能(J/mol)；,热灭菌致菌体死亡也是一级动力学反应，热致死速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示：式中A-灭菌反应的阿累尼乌斯常数(1/s ) E-灭菌反应所需的活化能(J/mol)； 前两式取对数，则得：,营养成分的破坏方程式,菌体死亡方程式,k,k,为灭菌温度和灭菌时间的选择提供依据和指导由 ，加热
25、灭菌时，灭菌温度发生变化，热致死速度常数 k 值和培养基成分分解反应速度常数 k 值都会变化情况，当温度由T1升至T2时，则：k1k2and k1k2 阿累尼乌斯方程经推导得出下式：,E：菌体死亡所需活化能 E：营养成分破坏所需活化能,k1,k2,k,k,由于杀死微生物的E营养成分破坏的E ，因此，即随温度上升，灭菌反应速度常数的增加倍数大于培养基营养成分破坏速度常数的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升，微生物死亡速率大于培养基成分破坏速率。,E：菌体死亡所需活化能 E：营养成分破坏所需活化能,k1,k2,k,k,在灭菌过程中，当温度升高时，两种反应过程的速度都在增加，但微生物死亡的速度增加值超
26、过培养基营养成分破坏的速度增加值。 采用高温快速灭菌方法，既可杀死培养基中的全部有生命的有机体，又可减少营养成分的破坏。,1、 培养基成分 培养基中的油脂、糖类和蛋白质增加微生物的耐热性，使微生物的热致死速率变慢，这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜，阻碍热的传入，因此应提高灭菌温度或延长灭菌时间。 相反培养基中高浓度的盐类(如8%以上NaCl溶液)、色素会减弱微生物细胞的耐热性，一般较易灭菌。 在固形物含量高的情况下，灭菌温度要高些。 培养基成分对大肠杆菌灭菌影响,二、影响培养基灭菌的其他因素P134,pH值对微生物的耐热性影响很大。pH值愈低，灭菌所需的时间愈短。 pH值6.0
27、8.0，微生物最耐热； pH值6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。,2、培养基pH值,3、培养基的物理状态 培养基的物理状态对灭菌有极大的影响。 固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，如果100时液体培养基的灭菌时间为1h，同体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。 其原因在于液体培养基灭菌时，热量传递是由传导作用和对流作用完成的，而固体培养基只有传导作用而没有对流作用。 此外，液体培养基中水的传热系数要比固体有机物质大得多。 越浓稠的培养基灭菌所需时间越长。,培养基中的颗粒小，灭菌容易；颗粒大，灭菌难。 一般含有1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，
28、但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。,4、微生物细胞含水量含水量少，蛋白质不易变性，但在灭菌时，如果是含水量很高的物品，高温蒸汽的穿透效果也会降低，所以灭菌时间也要延长。 5、 培养基中的微生物性质与数量 不同成分的培养基中含菌性质与量是不同的。 培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中的含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。 含芽孢杆菌和霉菌孢子多的培养基，要适当提高灭菌温度或延长灭菌时间。,6、冷空气排除情况 高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气
29、导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品。 降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度，如果灭菌器内冷空气排除不彻底，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力，还有空气的分压，罐内的实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够，检验灭菌器内空气排除度，可采用多种方法，最好的办法是发酵罐同时装有压力表和温度计。,空气排除情况,如果灭菌器内冷空气排除不彻底，罐内的实际温度低于压力表上所对应的温度，造成灭菌温度不够。,泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。,7、泡沫,液膜,空气,空气,工业生产中对于大量的培养基和发酵设备的灭菌，最有效、最常
30、用的方法是蒸汽灭菌(即湿热灭菌)。 培养基的灭菌包括分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备一起灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。 全程包括加热、维持、冷却三个过程。,三、培养基的灭菌,分批灭菌 连续灭菌,（一）分批灭菌（batch sterilization）,又称间歇灭菌，就是将配制好的培养基全部输入发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，是使培养基和发酵罐同时灭菌的一种方式。,灭菌流
31、程：培养基的加热一般用直接蒸汽通入罐内，冷却是冷却水通入蛇管或夹层间接进行。灭菌时间过程包括：加热、维持、冷却所需要的时间。各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%,优点： 设备要求低，不需要附加专门的加热和冷却设备，投资少； 操作简便，灭菌效果可靠； 对蒸汽的要求较低，一般0.2-0.3 MPa即可满足要求。,缺点 加热和冷却时间较长，营养成分有一定的损失； 罐利用率低； 不能采用高温快速灭菌工艺； 在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大； 冷却水用量大。,培养基分批灭菌的优、缺点：,流程操作：先预热一定时间，使物料溶胀均匀受热，预热90以上时，将蒸汽直接通入培养基及罐中，可减少冷
32、凝水生成量。温度达到120时计算维持时间。生产中常用维持时间30min。为了减少营养成分的破坏多采用快速冷却方式，立即向罐内通入无菌空气，以维持罐压,然后开启冷却系统进行冷却。,分批灭菌设备示意图,三路进汽：蒸汽从通风、 取样和出料口进入罐内 直接加热，直到所规定 的温度，并维持一定的 时间。这就是所谓的 “三路进气”。 四路出汽：在液面以上 的管道口则应排放空 气，即蒸汽从排气、接 种、进料和消沫剂管排 气。这样做可以达到不 留灭菌死角。,（二）连续灭菌(continuous sterilization),连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的
33、灭菌方式，也称之为连消。 连续灭菌设备主要由灭菌系统、冷却系统、烘干系统及电器系统组成。附属设备由进料输送带散布机，出料输送带等组成。 灭菌系统采用专一灭菌设备-连消塔(或器)。,优点： 高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 发酵罐的非生产占用时间短，容积利用率提高； 热能利用合理，适合实行自动化控制； 缺点： 不适用于粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加染 菌的机率。,连消塔-喷淋冷却连续灭菌的基本流程,流程：在短时间内使物料在连消塔中的温度达到灭菌温度126132，然后进入维持罐中保温5 8min，然后物料以层流(避免紊流造成混流、错流致使灭菌时间不
34、准的现象发生) 的方式保持先进先出、后进后出的状态流至维持罐出口完成灭菌时间，再进入冷却器快速换热冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。,喷射加热-真空冷却连续灭菌流程图,典型的蒸汽喷射式-真空冷却过程中培养基温度随时间的变化曲线,喷射器结构示意图,连续灭菌与分批灭菌的比较,1、连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。,2、分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺
35、点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,（三）固体培养基灭菌,固体培养基要先蒸煮灭菌,但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水加热易成团, 冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。,转鼓式灭菌器，可以0.51r/min转动，培养基能得到较为充分的混匀，轴的中心是一带孔的圆管，蒸汽沿轴中心通入鼓内培养基中进行加热，达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌结束后用真空泵对转鼓抽气，降低鼓内压力和培养基的温度。,例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为2105/ ml个耐热细菌芽孢， 121时灭菌
36、速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,解：N0 = 40106 2105 = 8 1012 (个)Nt = 0.001; K= 1.8 (min1),例2：有一发酵罐内装40m3培养基，在131温度下进行连续灭菌。原污染程度为2105/ ml个耐热细菌芽孢， 131时灭菌速度常数为15min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,解：C0 = 2105 (个/ml)Ct = 0.001 /(40106 )= 2.510-11 K= 15 (min1),三、发酵设备的灭菌,（1）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽，
37、使罐内蒸汽压力达0.147 MPa，维持45 min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过到达死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098 MPa。 （2）空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174 MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。 （3）种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80 ，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温至121 ，维持30min。谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110 ，维持10 min。 （
38、4）消泡剂灭菌 直接加热至121 ，维持30 min。 （5）补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121 ，维持5 min。 （6）尿素溶液灭菌 105 ，维持5 min。,本章内容,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌一、发酵使用的净化空气的标准二、空气净化的方法三、介质过滤除菌的原理四、空气净化的工艺流程,一、发酵使用的净化空气的标准,（一）无菌空气的概念发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。 （二）空气中微生物的分布空气中的含菌量随环境不同而有很大
39、差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。,（三）发酵对空气无菌程度的要求各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同： 不同菌种的
40、生产能力、生长速度、发酵周期、产物性质、培养基营养成分和pH的差异等不同，对空气质量有不同的要求； 发酵周期长短的不同：氨基酸和抗生素； 同一工厂的不同生产区域有不同的空气质量要求。一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。空气无菌程度用空气洁净度来表示，指洁净环境中空气含尘（微粒）量多少的程度。空气洁净度的具体高低用空气洁净度级别来区分，这种级别又是用操作时间内空气的计数含尘量（就是单位容积空气中所含某种大小微粒的数量）来表示的。,环境空气的洁净等级,二、空气净化的方法,空气净化就是除去或杀灭空气中的微生物。 主要有：热杀菌（加热灭菌）辐射杀菌静电除
41、菌过滤除菌,（一）热杀菌,利用压缩热进行空气灭菌的流程图,空气进口温度为21，出口温度为187198，压力为0.7MPa； 在实际应用中，对培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培养装置之间的管道的灭菌以及管道的长度等问题都必须考虑在连接压缩机和贮气罐之间的管路上加保温层； 加装空气冷却器，排除冷凝水，以防止在管道设备死角积聚而造成杂菌繁殖；,（二）辐射杀菌 1、原理射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。 2、应用范围通常用于无菌室和医院手术室。 3、缺点杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程
42、度。不适宜大规模的空气灭菌。,（三）静电除菌 1、原理利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒。但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘对很小的微粒效率较低。 2、优点阻力小，约1.01325104Pa染菌率低，平均低于10-15除水、除油的效果好耗电少,管式静电除尘器 1-钢丝（电晕电极）；2-钢管（沉淀电极）；3-高压绝缘瓷瓶；4-钢板；5-空气出口；6-封头；7-钢板；
43、8-法兰；9-空气进口。,3、缺点设备庞大、一次性投资较大、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。,三、介质过滤除菌的原理,（一）定义：让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。通过过滤处理的空气可达无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供耗氧培养过程使用。该法是目前广泛用来获得大量无菌空气的常规方法。,（二）空气过滤器 一个空气过滤器的功能是从气体中除去污染物（微生物）以使达到所需的气体的无菌程度。,过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子，过滤/分离是在一个平面上进行的。,实际上，空气过滤器的滤材具有深度。“弯曲通道”的结果对污染物的去除起到了辅助作用。,（三）绝对过滤和深层
44、过滤 绝对过滤：主要特点是过滤介质孔隙小于或大大小于被过滤的微粒直径，其孔隙小于0.5mm，甚至小于0.1mm（一般大小为1mm），将空气中的细菌除去。 深层过滤：污染物被过滤介质内部捕获的一种过滤方式，滤孔贯穿于整个介质厚度。又分为两种以纤维（以棉花、玻璃纤维、尼龙等）或颗粒状（活性炭）介质为过滤层，这种过滤层较深，其空隙一般大于50mm，即远大于细菌，因此这种除菌不是真正意义上的过滤作用，而是靠静电、扩散、惯性和阻截等作用将细菌截留在滤层中；用超细玻璃纤维（纸）、石棉板、烧结金属板、聚乙烯醇、聚四氟乙烯等为介质，滤层薄，但孔隙仍大于0.5mm，因此仍属于深层过滤的范畴。,绝对过滤表面过滤,
45、深层过滤,颗粒可以在表面被捕集， 也可以在介质深度被捕集， 因此，提高了容污能力。,（四）介质过滤除菌的原理 1、布朗扩散截留作用在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加微粒与纤维的接触滞留机会。在假设微粒扩散运动的距离为X，则离纤维表面距离小于等于X的气流微粒会因为扩散运动而与纤维接触，截留在纤维上。,2、拦截截留作用降低气流速度，可使惯性截留作用接近于零，此时的气流速度成为临界气流速度。气流速度在临界速度以下时，微粒不能因惯性滞留于纤维上，捕集效率显著下降。但实践证明，随着气流速度的继续下降，纤维对微粒的捕集效率又回升，说明有另一种机理在起作用，这就是拦截捕集作用。微生物微粒
46、直径很小，质量很轻，它随低速气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维所阻，从而改变流动方向，绕过纤维前进，而在纤维的周边形成一层边界滞流区。滞流区的气流速度更慢，进到滞流区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截捕集作用。,被随机运动的气体分子碰撞的颗粒撞击到过滤介质上并被吸附截留,3、惯性撞击截留作用在过滤器中的滤层交错着无数的纤维，好像形成层层的网格，随着纤维直径减小，充填密度的增大，所形成的网格就越紧密，网格的层数也就越多，纤维间的间隙就越小。当带有微生物的空气通过滤层时，无论顺纤维方向流动或是垂直于纤维方向流动，仅能从纤维的间隙通过。由于纤维交错所阻迫，使空气要不断改
47、变运动方向和速度才能通过滤层。当微粒随气流以一定速度垂直向纤维方向运动时，因障碍物(介质)的出现，空气流线由直线变成曲线，即当气流突然改变方向时，沿空气流线运动的微粒由于惯性作用仍然继续以直线前进。惯性使它离开主导气流；走的是图中虚线的轨迹。气流宽度b以内的粒子，与介质碰撞而被捕集。这种捕集由于微粒直冲到纤维表面，因摩擦粘附，微粒就滞留在纤维表面上，这称为惯性冲击滞留作用。,当流经过滤介质时流体必须沿弯曲通道行进。这将增加过滤机制的有效性。,当流体改变运动方向时，惯性使颗粒撞击到滤材表面并由于吸附力而停留,惯性捕集是空气过滤器除菌的重要作用，其大小取决于颗粒的动能和纤维的阻力，也就是取决于气流
48、的流速。惯性力与气流流速成正比，当流速过低时，惯性捕集作用很小，甚至接近于零；当空气流速增至足够大时，惯性捕集则起主导作用。空气流速v0是影响捕集效率的重要参数。在一定条件下(微生物微粒直径、纤维直径、空气温度)，改变气流的流速就是改变微粒的运动惯性力；当气流速度下降时，微粒的运动速度随之下降，微粒的动量减少，惯性力减弱，微粒脱离主导气流的可能性也减少，相应纤维滞留微粒的宽度减小，即捕集效率下降。气流速度下降到微粒的惯性力不足以使其脱离主导气流对纤维产生碰撞，即在气流的任一处，微粒也随气流改变运动方向绕过纤维前进。,停留的颗粒减小了滤孔的孔径,惯性撞击,4、重力沉降作用微粒虽小，但仍具有重力。
49、当微粒重力超过空气作用于其上的浮力时，即发生一种沉降加速度。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就发生沉降现象。就单一重力沉降而言，大颗粒比小颗粒作用显著，一般50m以上的颗粒沉降作用才显著。对于小颗粒只有气流速度很慢时才起作用。重力沉降作用一般是与拦截作用相配合，即在纤维的边界滞留区内。微粒的沉降作用提高了拦截捕集作用。 5、静电吸附作用干空气对非导体的物质作相对运动摩擦时，会产生静电现象，对于纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物大多带有不同的电荷。有人测定微生物孢子带电情况时发现，约有75的孢子具有160负电荷单位，15的孢子带有514正电荷单位，其余10则为中性，这些带电荷的微粒会被带相反电荷的介质所吸附。此外，表面吸附也属这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附作用。,
