1、 ICS 65.120B 46备案号：浙江省地方标准DB33DB33/T 5362005动物尿样中莱克多巴胺的测定Determination of ractopamine in animal urine2005-02-17 发布 2005-03-18 实施浙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB33/T 5362005I前 言本标准由浙江省农业厅提出并归口。本标准由浙江省畜产品质量安全检测中心、浙江省疾病预防控制中心负责起草，浙江一星集团饲料有限责任公司参与起草。本标准主要起草人：应永飞、吴平谷、陆春波、林仙军、周文海、任玉琴、屈健、浦琴华。DB33/T 53620051动物尿样中莱
2、克多巴胺的测定1 范围本标准规定了以酶联免疫（ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱质谱（GC MS）法检测动物尿样中莱克多巴胺的方法，规定GCMS法为仲裁法。本标准适用于动物尿样中莱克多巴胺的测定。酶联免疫（ELISA）法为筛选方法，检测限为 5g/L ，高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱质谱（GC MS ）法为定量方法，定量限HPLC 法为5g/L、 GCMS法为1g/L。线性范围：酶联免疫（ELISA）法为0.005ng-0.05ng，高效液相色谱（HPLC）法为2.5ng-10ng，气相色谱质谱（GCMS）法为0.05ng-1.0ng。2 规范性引用文件下列文件中的条款
3、通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 试样制备采集的尿样应保存于4左右的冰箱中。尿样如有混浊，应经离心处理。第一法 酶联免疫法4 原理与方法4.1 原理本方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的莱克多巴胺与标准或样品中的莱克多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结合，与标准品或样品相结合的莱克多巴胺抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药
4、物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，吸光度的高低与样品中莱克多巴胺的含量成反比。4.2 方法采用莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品，按试剂盒说明书操作。5 试剂和溶液5.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。5.2 PBS 缓冲液：用水 10 倍稀释厂商提供的浓缩 PBS 缓冲液。5.3 工作洗液：用水 20 倍稀释厂商提供的浓缩洗液。5.4 第二抗体工作液：用第二抗体稀释液 2500 倍稀释第二抗体。6 仪器与设备6.1 微孔板酶标仪(带 450nm 滤光片) 。DB33/T 536200
5、526.2 振荡器。6.3 冷冻离心机。6.4 微量加样器及配套吸头：20L, 50L, 100L, 200L 。6.5 冰箱。6.6 洗板机。6.7 生化培养箱。6.8 分析天平：感量 0.01g。7 测定步骤7.1 注意事项不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。7.2 样品处理把试样于4000rpm的转速离心10min，取上清液用PBS缓冲液（5.1）稀释十倍后直接加入微孔进行ELISA测定。7.3 测试程序7.3.1.1 根据所测定样品及标准数，计算出所需微孔条数，将微孔条插入微孔架，标准和样品做两个孔的平行重复，记录标准和样品的位置。7.3
6、.1.2 加入 50L 的标准品和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行重复。7.3.1.3 加入 100L 第一抗体溶液到每一个微孔中，在 37孵育 30 分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（5.2）250L，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。7.3.1.4 加入 150L 稀释的酶标记的第二抗体（5.3）37孵育 30 分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（5.2）250L，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。7.3.1.5 加入 100L
7、酶底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育 5-10min。7.3.1.6 加入 50L 反应终止液到微孔中，混合后在 450nm 处测量吸光度值。8 结果计算以空白（浓度为0的标准溶液）吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。标准的吸光度值(或样品)相对吸光度值（%） = 100 空白的吸光度值计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng/L)可以从校正曲线上读出。第二法 高效液相色谱法9 方法原理用叔丁基甲醚为提取剂提取动物尿样中的莱克多巴胺，经固相萃取柱净化，
8、浓缩后用2乙酸溶液定容，用高效液相色谱荧光检测法分离测定。 10 试剂和溶液DB33/T 5362005310.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。10.2 乙腈：色谱纯。10.3 甲醇。10.4 冰醋酸。10.5 乙酸乙酯。10.6 叔丁基甲醚。10.7 无水硫酸钠。10.8 戊烷磺酸钠：色谱级。10.9 氢氧化钠。10.10 氯化钠。10.11 1mol/L NaOH 溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液 56mL，加水至 1000mL，摇匀。10.12 2乙酸溶液：5mL 冰醋酸加水至 250mL，混匀。10.13 3甲醇/乙酸乙酯溶
9、液：取 15mL 甲醇加乙酸乙酯至 500mL，混匀。10.14 50甲醇/乙酸乙酯溶液：取 250mL 甲醇加乙酸乙酯至 500mL，混匀。10.15 戊烷磺酸钠溶液：取 800mL 水，加 20mL 冰醋酸和 0.87g 戊烷磺酸钠（10.7，C 5H11O3SNaH2O），混匀。10.16 固相萃取柱 1：每根柱填料量为 500mg，柱体积 5mL。10.17 莱克多巴胺标准溶液：莱克多巴胺贮备液（250g/mL）：精密称取莱克多巴胺对照品25mg ，置100ml容量瓶中，用甲醇（10.2）溶解并定容至刻度，其浓度为250g/ml，置-20冰箱中，可保存3个月。莱克多巴胺稀释液（5g/m
10、l）：精密量取1ml莱克多巴胺贮备液（10.16.1），置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，为莱克多巴胺工作液。莱克多巴胺工作溶液 ：分别准确吸取一定量的标准稀释液（10.16.2），用2乙酸溶液（10.11）稀释、定容，配制成浓度为0.05g/mL、0.1g/mL、0.2g/mL、0.5g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL的标准溶液。11 仪器设备11.1 高效液相色谱仪（配荧光检测器）。11.2 冷冻离心机。11.3 振荡器。11.4 分液漏斗 100mL。11.5 微孔滤膜 0.45m。 11.6 涡旋混合器。11.7 分析天平 精度 0.0001g。11.8 旋转蒸发仪
11、。11.9 鸡心瓶 50mL。11.10 离心管 50mL，10mL。11.11 氮吹仪。12 测定步骤1固相萃取柱的填充料为硅藻土和硅胶。DB33/T 5362005412.1 试样提取取试样10.0mL至50mL离心管中，用1mol/LNaOH 溶液调节pH值为10，加1g氯化钠（10.9），振摇数秒，加10mL叔丁基甲醚（ 10.5）提取，涡旋1min，中速振荡 10min，7000rpm离心5min，取上清液经无水硫酸钠（10.6）过滤，收集于50mL鸡心瓶中；另取10mL叔丁基甲醚重复提取一次。用2mL 叔丁基甲醚洗涤无水硫酸钠，旋转蒸干。12.2 试样净化用2mL乙酸乙酯（10.4
12、）溶解鸡心瓶中的残余物，过固相萃取柱（10.15，先经5mL甲醇和5mL 乙酸乙酯润洗）；另取3mL 3甲醇/ 乙酸乙酯（10.12）洗涤鸡心瓶的残余物一次，过柱；再用5mL 50甲醇/ 乙酸乙酯（10.13）洗脱，氮吹至干。 12.3 定容用2乙酸溶液（10.11）定容到1mL，过膜，上机。12.4 测定12.4.1 高效液相色谱条件色谱柱：C 18柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5m ，或相当者。保护柱：C 18柱，长20mm，内径3.9mm，粒径5m ，或相当者。流动相：戊烷磺酸钠溶液（10.15）：乙腈（10.1）80：20，使用前脱气。流速：1.0mL/min。激发波长：226
13、nm。发射波长：306nm。进样量：50L。12.4.2 上机测定取相应浓度的标准工作液和样品制备液，分别注入液相色谱仪，作单点或多点校准，以色谱峰面积按外标法积分定量。13 结果计算与表达试样中莱克多巴胺的含量按下式计算： 1000AiCsVs X AsVi 式中：X样品中莱克多巴胺的含量(gL)Ai样品峰面积 As对照溶液峰面积 Cs对照溶液浓度（g/ mL ） Vi样品体积（mL） Vs定容体积（mL）测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 2 位有效数字。14 精密度14.1 重复性 实验室内平行测定间的相对偏差不大于10。14.2 再现性 实验室间测定的相对偏差不大于15。DB33
14、/T 53620055第三法 气相色谱-质谱法15 方法原理用叔丁基甲醚为提取剂提取动物尿样中游离的莱克多巴胺，然后用固相萃取柱净化，BSTFA （双三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GC/MS 法进行定性定量分析。16 仪器与试剂16.1 气-质联用仪。 16.2 烘箱。16.3 BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS （三甲基氯硅烷）。16.4 莱克多巴胺标准贮备溶液（5mg/mL）：准确称取 50mg 莱克多巴胺于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用。16.5 莱克多巴胺标准工作溶液：取莱克多巴胺标准贮备溶液，用甲醇稀释至
15、所需浓度。16.6 甲苯。16.7 其它仪器，同 11。16.8 其它试剂，同 10。17 测定步骤17.1 试样提取同HPLC法12.1。17.2 试样净化同HPLC法12.2。17.3 试样衍生 蒸发剩余物加0.1 mL BSTFA+1%TMCS（16.3），加盖瓶于旋涡混合器上震荡，在80的烘箱中加热1.0 h，氮气吹干，加0.2mL甲苯（16.5）溶解。取适量的莱克多巴胺标准工作溶液，氮气吹干，与试样同法进行衍生化。17.4 色谱条件 色谱柱：5% 苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m0.25 mm0.25m) ，或相当者。进样口温度：300。柱温程序：初温150，保持3 min
16、，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至280保持10min。 载气：高纯氦气（99.999% ）。流速：1.0mL/min，不分流进样。进样量：1.0l。17.5 质谱条件 EI源：源温230。 电子能量：70eV 。 接口温度：280。 电子倍增器电压：1506V。 质量扫描范围：30550U。选择离子监测方式（SIM）。监测离子（m/z）：267、250 、179、502 。溶剂延迟：5 min 。DB33/T 5362005617.6 上机测定莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入气相色谱质谱联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。18 结果计算结果按下式计算：X=m1n/m 式中：X样品中莱克多巴胺含量（ ng/g）m1质谱测定对应莱克多巴胺量（ng）m取样量（g）n稀释倍数 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 3 位有效数字。19 精密度19.1 重复性 实验室内平行测定间的相对偏差不大于10。19.2 再现性 实验室间测定的相对偏差不大于15。
