1、第 十 章 三羧酸循环,Tricarboxylic Acid Cycle,第 一 节 三羧酸循环的发现,Discovery of the Citric Acid Cycle,乙酰CoA,TCA循环,2H,呼吸链,H2O,ADP+Pi,ATP,CO2,* 营养物在生物体内氧化的一般过程,一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分解的（共同）第二阶段,在真核生物，TCA循环在线粒体中进行，与呼吸链在功能和结构上相偶联。,三羧酸循环亦称柠檬酸循环（citric acid cycle），这是因为循环反应中的第一个中间产物是一个含三个羧基的柠檬酸。由于Krebs正式提出了三羧酸循环的学说，故此循环又称为Kreb
2、s循环。,二、Krebs发现三羧酸循环,1937年，Hans Krebs利用鸽子胸肌（这块肌肉在飞行中有相当高的呼吸频率，因此特别适合于氧化过程的研究）的组织悬液，测定了在不同的有机酸作用下，丙酮酸氧化过程中的耗氧率，首次提出在动物组织中丙酮酸氧化途径的假说。,Albert Szent-Gyorgyi等已经发现动物肌肉组织中某些4碳二羧酸（琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸）能刺激氧的消耗。 Krebs证实了这项发现，并且发现它们也可刺激丙酮酸的氧化过程。而且他还发现肌肉中丙酮酸的氧化还可被6碳三羧酸，如柠檬酸、顺乌头酸和异柠檬酸及5碳的-酮戊二酸激活。上述有机酸的激活效应是显著的，任何一种这
3、些有机酸的增加，甚至是很少量的增加都能大大激活丙酮酸的氧化过程。,Krebs的第二项重大发现是观察到丙二酸对丙酮酸有氧氧化的抑制作用。 丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，在肌肉悬浮液中，无论加入上述哪一种有机酸，只要丙二酸存在，丙酮酸的有氧氧化过程就会被抑制。这表明在涉及丙酮酸氧化的酶促反应中，琥珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键的成分。 Krebs进一步发现，当用丙二酸去抑制肌肉组织悬液中的丙酮酸的有氧氧化时，在这个悬液介质中就会有柠檬酸、-酮戊二酸和琥珀酸的积累，这表明柠檬酸和-酮戊二酸通常为琥珀酸的前体。,根据上述实验观察和一些其他的证据，Krebs得出一个结论：上述有机
4、三羧酸和二羧酸可以以一个符合化学逻辑的序列排列。因为用丙酮酸和草酰乙酸与肌组织共同孵育，即可导致溶液介质中柠檬酸的堆积，所以Krebs推理这一系列反应是以循环的方式而不是以线性的方式存在，即它的开始和结尾是连在一起的。,从这些简单的实验和逻辑推理中，Krebs假定他所称的柠檬酸循环是肌肉中碳水化合物氧化的主要途径。柠檬酸循环也称TCA循环，因为在Krebs提出这个循环假说的若干年以后，还不确定柠檬酸或者一些其它的三羧酸，例如异柠檬酸是否是由丙酮酸和草酰乙酸反应所形成的第一个产物。自Krebs提出TCA循环的假设后，研究发现该循环不仅在肌肉组织中起作用，而且在需氧动物和植物的所有组织中，以及许多
5、需氧微生物中均发挥着功能。,TCA循环最初只是建立在实验基础上的假说。随后，在体外对参与循环中酶的研究证实并阐明了该循环的细节。但是这些酶是否在完整的活细胞的循环中真正发挥功能？细胞内该循环的效率是否足以解释动物组织中葡萄糖氧化的效率？这些问题已经通过用同位素标记的代谢物研究（如丙酮酸或乙酸酯分子中特定碳原子的13C或14C标记等同位素示踪实验），证实TCA循环确实以很高的效率在活细胞中存在。现在TCA循环已被公认为是营养物分解代谢的必经途径。,第 二 节 三羧酸循环的反应过程 Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle Reactions,TCA循环是一个由一
6、系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由乙酰CoA（主要来自于三大营养物质的分解代谢）与草酰乙酸缩合生成含3个羧基的柠檬酸（citric acid），再经过4次脱氢、2次脱羧，生成4分子还原当量（reducing equivalent）和2分子CO2，重新生成草酰乙酸的这一循环反应过程称为三羧酸循环。,还原当量（reducing equivalent ） 一般是指以氢原子或氢离子形式存在的一个电子或一个电子当量。,一、TCA循环由八步反应组成循环反应途径,（一）乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸,乙酰辅酶A（acetyl CoA）与草酰乙酸（oxaloacetate）缩合成柠檬酸（
7、citrate）；反应由柠檬酸合酶（citrate synthase）催化。,（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸,此反应是由顺乌头酸酶催化的异构化反应。 由两步反应构成，(1) 脱水反应；(2) 水合反应。,（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为-酮戊二酸,异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase）作用下，氧化脱羧而转变成 -酮戊二酸（ - Ketoglutarate）。,（四）-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰 CoA,在-酮戊二酸脱氢酶复合体催化下-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA(succinyl-CoA)； 该脱氢酶复合体的组成及催化机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似。,
8、（五）琥珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化反应,在琥珀酰CoA合成酶催化下，琥珀酰CoA的高能硫酯键水解与GDP磷酸化偶联，生成琥珀酸、GTP和辅酶A。 这是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸键的反应。,目 录,（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸,此步反应由琥珀酸脱氢酶催化，其辅酶是FAD，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶。,（七）延胡索酸加水生成苹果酸,延胡索酸酶催化此步反应,（八） 苹果酸脱氢生成草酰乙酸,苹果酸脱氢酶催化此步反应，辅酶是NAD+。,目 录,NADH+H+,NAD+,NAD+,NADH+H+,GTP,GDP+Pi,FAD,FADH2,NADH+H+,NAD+,柠檬酸合酶,顺乌头酸酶
9、,异柠檬酸脱氢酶,-酮戊二酸脱氢酶复合体,琥珀酰CoA合成酶,琥珀酸脱氢酶,延胡索酸酶,苹果酸脱氢酶,目 录,二、一次TCA循环生成2分子CO2,在TCA循环反应过程中，从2个碳原子的乙酰CoA与4个碳原子的草酰乙酸缩合成6个碳原子的柠檬酸开始， 反复地脱氢氧化。 TCA循环中通过脱羧方式生成CO2。1个二碳单位进入TCA后，有2次脱羧反应，生成2分子CO2，这是体内CO2的主要来源。 TCA循环过程中，共有4次脱氢，其中3次脱氢由NAD+接受，1次由FAD接受。,TCA循环过程中，共有4次脱氢，其中3次脱氢由NAD+接受，1次由FAD接受。 TCA循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化生成1
10、个ATP。,TCA循环总反应式：,CH3COSCoA + 3NAD+ +FAD + GDP + Pi + 2H2O 2CO2 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + HSCoA + GTP,三、TCA循环的中间产物本身并无量的变化,TCA循环的中间产物包括草酰乙酸在内起着催化剂的作用，本身并无量的变化。 不可能通过TCA直接从乙酰CoA合成草酰乙酸或其他中间产物；同样，这些中间产物也不可能直接在TCA循环中被氧化生成CO2和H2O。 TCA循环中的草酰乙酸主要来自丙酮酸的直接羧化，也可通过苹果酸脱氢产生。无论何种来源，其最终来源是葡萄糖。,第 三 节 三羧酸循环的调控 Regulati
11、on of Tricarboxylic Acid Cycle,一、丙酮酸脱氢酶复合体的活性变化可影响乙酰CoA的生成,别构调节 当脂肪酸或乙酰CoA充足时，或ATP/ADP 和 NADH/NAD_比值增高时，该酶活性被别构抑制； 而当机体需要能量时，或ATP/ADP降低时，该酶被AMP等变构激活。 化学修饰调节 当胞内ATP增高时，丙酮酸脱氢酶复合体成分中的丙酮酸脱氢酶（E1）由于磷酸化而失活； 当ATP减少时，磷蛋白磷酸酶去除E1上的磷酸基团而激活该复合体。,二、TCA循环受底物、产物和调节酶活性调节,TCA循环的速度和流量主要受种因素的调控：,底物的供应量 催化循环最初几步反应的酶的反馈别
12、构抑制 产物堆积的抑制作用,（一）TCA循环中有个调节调节酶,TCA循环中催化个不可逆反应的酶：,柠檬酸合酶 异柠檬酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶,柠檬酸合酶,-酮戊二酸 脱氢酶复合体,柠檬酸,Ca2+, ATP、ADP的影响, 产物堆积引起抑制,循环中后续反应中间产物别位反馈抑制前面反应中的酶,其他，如Ca2+可激活许多酶,三羧酸循环的调节,（二）TCA循环与上游和下游反应协调,在正常情况下，（糖）酵解途径和TCA循环的速度相协调； 氧化磷酸化的速率对TCA循环的运转也起着非常重要的作用。,三、TCA循环的多种酶以复合体形式存在于线粒体,TCA循环中的酶在线粒体中是以多种酶组成的
13、复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室（metabolons），它在细胞内能够有效地将代谢中间产物从一种酶传递给另一种酶。这些复合体具有高效介导中间产物流通的功能，因此也可影响代谢的速率。,第四节 三羧酸循环的生理意义 Physiologic Significance of Tricarboxylic Acid Cycle,一、TCA循环是一条“两用代谢途径”,TCA循环在大多数生物中是分解代谢途径; 多种生物合成途径也利用TCA循环的中间产物作为合成反应的起始物。,（一）TCA循环参与合成和分解途径的组成,TCA中间产物,（二）TCA循环中间产物是合成糖、脂肪酸和氨基酸的前体,1. TC
14、A循环中间产物可以异生为糖,草酰乙酸,异生为葡萄糖,氨基酸,乙酰CoA,2. TCA循环中间产物可为脂酸合成提供原料,合成脂酸,柠檬酸-丙酮酸循环,-酮戊二酸 + NH4+,3. TCA循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架,谷氨酸,谷氨酸脱氢酶,NADH + H+,NAD+,（三）添补反应补充TCA循环中间产物,参与其他代谢途径而消耗的TCA循环中间产物必须及时补充，才能保持TCA循环顺利进行。这类反应被称为添补反应（anaplerotic reaction）。 最重要的添补反应是由丙酮酸羧化酶催化的，从丙酮酸生成草酰乙酸的反应。,乙酰CoA是丙酮酸羧化酶的激活剂； TCA循环中的酶促反应
15、可以将草酰乙酸转变为其他中间产物； 此外，可由别的途径生成一些中间产物，如：,二、TCA循环在三大营养物质代谢中具有重要生理意义,（一）TCA循环是三大营养物质的最终代谢通路,（二）TCA循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联系的枢纽,第五节 三羧酸循环关键反应的分析原理 Analytical Principles of Key Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle,一、采用分光光度法测定硫氢辅酶A生成量分析柠檬酸合酶活性,反应生成的辅酶A和5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DNTB）在pH 7.4、0.1 M 三乙醇胺和 0.2 M 乙二胺四乙酸钙钠（EDTA
16、）溶液中反应生成硫氢辅酶A，其在412 nm时有吸收峰，通过分光光度计测定吸光度，测定硫氢辅酶A的生成量。以此反映柠檬酸合酶酶活性。,二、采用分光光度法检测NADH生成量分析异柠檬酸脱氢酶活性,反应中异柠檬酸脱氢酶酶活性的检测主要通过测定生成的NADH在340 nm吸光度。检测体系包括120 mM 的D，L-异柠檬酸三钠 ，30 mM 的硫酸锰, 20 mM 的NAD+ 及异柠檬酸脱氢酶。,三、采用分光光度法测定NADH生成量分析-酮戊二酸脱氢酶活性,通过测定NADH在340 nm时吸光度的变化反映-酮戊二酸脱氢酶复合体酶活性。检测体系包括1.0 ml的磷酸盐；0.15 ml 的辅酶A；0.1 ml 的半胱氨酸; 0.1 ml NAD+；0.5ml的酶。,四、采用分光光度法测定顺乌头酸生成量分析顺乌头酸酶活性,检测体系包括100 mmol/L 的氯化钠，30 mmol/L柠檬酸钠, 20 mmol/L Tris/HCl 和酶，在 1.00 ml反应终体积，pH 7.4的溶液中，反应在25进行，通过检测顺乌头酸在240nm的吸光度反映顺乌头酸酶的酶活性。,
