米根霉生产平台化学品的代谢工程.doc

1、米根霉生产平台化学品的代谢工程摘要米根霉属于接合菌的丝状真菌。它能够持久的产生平台化学品 L -（+）- 乳酸，延胡索酸和乙醇。在糖酵解过程中，所有可发酵的碳源被代谢为丙酮酸并随后分布到形成这些产品的途径中。这些平台的形式化学品的生产，在一个广泛的碳源范围内，是高收率的。L - （+）- 乳酸和乙醇的理论产率超过85，延胡索酸的在 65以上。参与生产这些化合物代谢途径的研究和优化，需要发达的代谢工程技术和这个有机体基因构成的知识。本文着重介绍了目前米根霉的代谢工程技术及其主要发酵产物代谢途径的应用。关键字米根霉、代谢工程、代谢途径、转化、外源基因表达介绍估计在未来的几十年里，煤炭，石油和天然气

2、等化石资源耗尽或不能大量使用。当前不断增加的成本,产油地区的地缘政治不稳定,可持续发展问题都导致了这个问题。发展替代能源取代化石资源的原料，这样就形成了强烈的契机。已经出现地热、水、风、太阳能、核能形式的能源发电。唯一可行的替代运输燃料和平台形式的化学物质的生成，是生物质产品。借助微生物的发酵过程，生物质可以转换成生物质燃料和平台化学品。为了能够与工艺基础上的石油化工原料竞争，这些微生物应该表现出较高的产品产量（克每克） ，生产力（克每升每小时） ，和产品的效价（克每升） 。其他的先决条件是能够使用许多碳源,抵抗生物质预处理释放的发酵抑制剂,能够在没有复杂的生长因子中生长等。米根霉是一种能够在

3、高含量的生物质衍生糖中生产乙醇，L-（+） - 乳酸，延胡索酸的真菌。这些发酵产物的市场大，表明了这种微生物生产平台化学潜能。在 2000 年，全球生产的乙醇为 17.25 十亿公升，而且到 2009 增加的量超过 740 亿升。到 2020 年，这个市场预计将增加超过 1250 亿升。全球市场的 L - （+）-乳酸在 2000 年超过 100,000 吨， ，2012 年预计将增加 259000 吨。L-（+） - 乳酸，目前主要用作食品或饲料酸化剂，但它也可以被用于在快速市场中的的可再生塑料，溶剂，或含氧化合物和动物饲料。延胡索酸的市场规模较小，但 2007 年估计量仍有 90,000

4、吨。这个市场也有望在未来几年内增加。延胡索酸目前在食品工业中直接作为 pH 调节剂，防腐剂，增香剂使用。由于它的结构，它可作聚酯和醇酸树脂的产物离子。除了这些平台化学品，米根霉也可用于各种各样商业有关酶的生产。Ghosh 和 Ray 最近都在生物技术工艺中应用米根霉。代谢工程技的使用，使米根霉产物的形成得到优化，通过同源基因过度表达，或淘汰现有相互竞争的途径，使异源基因引入化学品的生产。本文综述了国家当前最先进的分子生物学技术用于米根霉通路工程以及如何用它们来研究和提高其主发酵产品的产量。米根霉有机体米根霉是丝状真菌，是接合菌纲的毛霉菌目。根霉属的黑根霉的描述在1820 年首次建立，以形成发酵

5、产物而闻名，如乙醇，L-（+） - 乳酸，延胡索酸，以及在一定程度的 L-（+）-苹果酸。曲霉菌，镰刀菌，和青霉是有生产延胡索酸的能力。米根霉在亚洲常用于食品发酵，生产酒精饮料， 鸭脚稗，或豆豉，通常视为安全菌株。尽管如此，米根霉也可能成为人类病原体，毛霉真菌病感染后具有较高的患病率。大多数毛霉菌感染病例有潜在的疾病，如血清铁水平升高，外伤，或免疫系统削弱。米根霉是在自然界普遍存在，并且发现也存在在腐烂的有机材料上。它能够在各种各样的碳源上生长，例如，甘油，乙醇，乳酸，葡萄糖，甘露糖，果糖，蔗糖，木糖，纤维二糖，脂肪酸，和油。所有提及的糖都证明是 L -（+）-乳酸或延胡索酸生产离子的一种底物

6、。此外，米根霉具有分解淀粉，木聚糖，果胶，纤维素的能力，能够转化农业残留物中的聚合物。它能够在很宽的温度范围内（不超过 40）和 pH 值范围内（从 4 至 9）生长良好，这表明了它的强大性能和广泛适应潜力。米根霉生产的化学物质第一个提及米根霉有产生有机酸的能力是在 Saito1911 年用华根霉生产乳酸和 Ehlich 用黑曲霉主要生产延胡索酸及乳酸，琥珀酸，和苹果酸的报道中。Takahashi 和他的同事的研究表明，还有其他的产品形成，如乙醇。Ward 等人，利用米根霉在葡萄糖中生产 L - （+） - 乳酸，最终产率为 0.62 克/克。从那时起，米根霉已被广泛的用于生产有机酸，乙醇，酶

7、，和其他市售产品。最近Ghosh 和 Ray 做了这些研究。正如前面提到的，米根霉能够高效地生产发酵终产物。有氧呼吸 L-（+）- 乳酸生产的最大理论产率是 2 摩尔的 L - （+） - 乳酸每摩尔的 D-葡萄糖的消耗，即 1.0 克 L - （+） - 乳酸每克 D-葡萄糖。延胡索酸的最大理论产率是 2摩尔延胡索酸每摩尔的 D-葡萄糖的消耗，即 1.3 克延胡索酸每克 D-葡萄糖。L-（+）-乳酸的最高产量为 0.88 克/克，延胡索酸的最高产量是 0.86 克/克，主要副产物为乙醇。这些还表明米根霉能够抵抗高浓度产物和超过 100 克/升 D-葡萄糖的浓度的能力。理论产率是 2 摩尔的乙

8、醇每摩尔 D-葡萄糖的消耗（0.51克/克 D-葡萄糖） 。当米根霉生长在 D-葡萄糖中时，得到产率接近这个最大收率。表 1 列出了米根霉生产乙醇的一些实验数据。目前利用 D-葡萄糖用于乙醇生产的微生物是酿酒酵母。用于乙醇生产的野生型酿酒酵母的主要缺点是不能利用半纤维素水解物中的戊糖。米根霉可以在许多碳源上生长，如 5 碳糖，而且生长要求低。此外，它是能够耐受存在于木质纤维素生物质的酸水解物中的抑制剂，并有直接利用纤维素和半纤维素进行缓慢生长的能力。米根霉的遗传多样性在 D-葡萄糖上生长时，米根霉可根据主要产生的有机酸分为两种类型。其中一组主要产生 L-（+）- 乳酸，而另一组是主要的发酵产物

9、是延胡索酸和 L-（+） - 苹果酸。对乳酸脱氢酶（LDH）的编码基因和蛋白质进行分析，获得一些信息。测定米根霉 NRRL395有两种 NAD-依赖同工酶（LDHA 和 LDHB） 。在生长过程中有可发酵碳源如 D-葡萄糖，D-木糖，海藻糖的存在的时候 LDHA 编码基因被表达。与此相反，有不可发酵碳源如乙醇，甘油，乳酸的时候 LDHB 编码基因的表达。Saito 等人发现了 L-（+） - 乳酸生产与编码基因之间的关系。产L-（+） - 乳酸菌株含有 LDHA 和 LDHB 时候被分为 I 型菌株。延胡索酸和 L - （+） - 苹果酸生产菌株只含有 LDHB 被分为 II 型菌株。从两种不

10、同类型的各种基因和标记序列分析后，确定它们的系统发育不同。在这些结果的基础，提出了对产延胡索酸和 L-（+） - 苹果酸为主的菌株重新分类，如代氏根霉。这是第一个属于 II 型菌株根霉的名字。 拟议重新分类的 II 型菌株代氏根霉不是广泛应用。因此，代氏霉菌仍被称为米根霉。基因组分析2004年，米根霉99-880（II 型株）的基因组出版了。这对这一领域的研究做出了巨大的贡献，对分子技术有了新的见解。该菌株是第一个被作为接合菌世系测序的有机体。它在 Ma 等人分析出的基因复制中十分重要。 99-880米根霉的基因组是45.3 Mbp 大小，包括20的转座子。总共对13,895个蛋白编码基因进行

11、了预测，没有转座子重叠。对重复基因对和他们共同的进化序列分析后，得出的结论是发生共同祖先的全基因组复制事件。与新基因复制结合导致两到十倍增加基因家族相关的病原体毒力,特殊真菌细胞壁合成和信号转导。全基因组复制允许在多元化的不利条件下生长。这可能包括宿主的免疫防御反应，并能解释在感染毛霉菌病中米根霉菌的高患病率。由于全基因组的重复，通路通过基因敲除或沉默策略进行修改遇到相当大的困难。属于毛霉目的真菌的转化 目前有几种毛霉目生物体转化系统的研制，包括的灰绿犁头霉，卷枝毛霉，米黑毛霉，布拉克须霉，雪白根霉和微小根毛霉。在一般情况下，毛霉目异源基因表达的关键是 DNA 重组导入和复制机制的影响。通过转

12、化引入的 DNA 将保持额外染色体和自主复制，因为它不要求特定的复制起点。因此，转化通常表现出分裂不稳定型。这些质粒的中除了自主复制，还将形成高分子量的级联结构。这些结构将基因组 DNA 迁移，从而导致整合的不正确。为了增加在米根霉整合的可能性，同源区域的质粒在改造中引入双链断裂（DSB） 。这使发生整合增加到20%,剩下的仍含有质粒连接。据推测，级联质粒是整合到基因组中的重新连接之前的结果。这种可以重新连接的修复机制被称为非同源末端连（NHEJ） 。发生 NHEJ 时，只有少数几个的同源碱基对空闲。当两端的同源性越大，占主导地位的修复方法是单链退火（SSA） 。对 DNA 修复的深入研究，我

13、们采取帕尔多等人的研究。选择针对已经在载体选择标记区进行移码突变的 NHEJ，与一个已经在基因组的选择标记区发生突变的受体菌株结合。生长只有当质粒由一个单一的同源交叉到基因组中整合时才恢复，这会导致一个功能的选择标记和一个包含突变的拷贝。改造后这个载体，转化测试显示只有8的是原养型。转化体的其余部分仍含有级联质粒。当对所涉及的基因序列进行了分析时，它是载体上的非功能性拷贝的修复，而不是基因组拷贝。据推测，这是由于非交叉机制如打破诱导复制或依赖合成链退火。另一项研究可，能是在 NHEJ 中加强双链断裂修复对 DNA 断裂的影响。在这个实验中，载体酶切成一个个含有单一位点的悬浮物添加到无细胞提取物

14、中，温育30分钟后，观察载体的二聚物，三聚物和降解产物。温育到1.5小时延伸，会使二聚体和三聚体的减少了及高分子量的结构的出现。基于载体中包含的5或3突出对孢子进行改造，在恢复原养型生长，观察到无明显差异。在同一研究中，一个载体,选择整合到基因组中。此载体含有一个被截断的 pyrG 选择标记物，含有该5端一半的基因。受体菌株已经包含在选择标记的基因组复制3端一半处的一个点突变。可行的转化只可以通过基因组发生整合的方式获得。所有的转化体生成于选择标记的截断，进行载体整合和经常出现多拷贝插入的测试。截断载体转化效率与非截断载体的相比低20倍，这很可能是选择单一整合引起的。米根霉的代谢工程技术有几种

15、方法已被应用于改变米根霉的基因组及其转录中。这些方法基于引入外源 DNA 或随机突变。 米根霉的随机诱变随机突变对破坏基因的功能或提高生产力的代谢过程是一种强有力的方式。在米根霉中可以通过化学诱变来完成。例如利用 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍产生营养缺陷型突变体，或用硫酸二乙酯增加 L-（+） - 乳酸的产量。随机诱变可以通过紫外辐射，钴-60的 射线，或由低能离子注入产生。这种技术的缺点是会形成多个基因突变。同时需要花费很长时间用于检查和筛选。要用有效的筛选方法筛选出所需的突变体，如利用黄等人发明的筛选方法筛选高产酸突变体。本研究使用紫外辐射诱变米根霉孢子，并根据酸化的琼脂平板上 PH

16、指示剂颜色的变化进行筛选。异 源 DNA 转 化除了前面所述的随机诱变，另一种改变基因组的方法是异源 DNA 的导入，近年来有关米根霉的（异源性）基因表达的研究进展很快， ，并且描述了三个转化系统。其中一个系统是基于微生物根癌农杆菌 DNA 转移。农杆菌可以将将其 DNA 的一部分即转移 DNA（T-DNA）转移到了受体中去，对于异源表达来说，T-DNA 是改变的目的基因。重组后，T-DNA 整合到染色体上。Michielse 等人证明了基因重组的原理。米根霉有一种乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶的 pyrG 基因突变体，这是由于T-DNA 插入引起的。使用原生质体作为起始原料，可产生转化体，但不能

17、是孢子或萌芽孢子。总之，所有的有丝分裂在非选择性条件下稳定时，分离出8个转化子。经过进一步的分析，发现两个转化子发生基因重组。这种重组不引入额外的 DNA，不能恢复 pyrG 基因组的的复制功能。余下的6个转化子，基因组中pyrG 复制整合。有趣的是，在6个转化子的 DNA 引入整合轨迹表示整合在同一点。在基因组中检测到没有 DNA 载体连接的 T-DNA 或另外连接的基因。这个系统中目的基因不表达，因此，虽然基因重组了，但异源基因不表达。这可能是合成的毒力蛋白因子包裹 DNA 并阻止重组发生。描述 DNA 转移的另一种方法出现在土壤杆菌的系统研究中，.在这种方法中，从菌丝体中产生原生质体，并

18、通过 CaCl2/PEG 的方法进行 DNA 载体的转化。本研究采用直线形或圆形的 DNA 载体以增加重组的概率。在农杆菌系统相比，其产生的表型不稳定，并且 DNA 载体仍然保持独立和能自主复制。第三个介绍 DNA 的系统是粒子轰击 DNA 传递系统。粒子轰击系统首次用来介绍植物细胞中的 DNA。它是目前国内在米根霉中唯一成功用于异源基因表达的系统。在这个系统中，使用包被有钨粒子的 DNA 载体转化孢子。对于米根霉，它首先被用来判断 NRRL395米根霉的尿嘧啶营养缺陷型菌株中导入的 DNA 的命运。尿嘧啶营养缺陷型通过引入同一菌株的 pyrG 拷贝功能的载体来进行补充。多年来，这个系统进一步

19、完善来表达同源基因如 LDHA。其次是绿色荧光蛋白（GFP）的表达作为异源基因表达的证明。2007年，来源于米根霉99-880II型菌株的尿嘧啶营养缺陷型与 I 型菌株 ldhA 基因发生转化。在这株功能实现异源基因表达与藻青素合成酶编码基因（CPHA）从蓝藻的目标产生蓝藻米根霉。在这个菌株中，功能性异源基因通过与源于蓝藻的合成酶编码基因（CPHA）结合进行表达，达到从米根霉中生产藻青素的目标。藻青素具有独特的结构，可作绿色化学品的产品。此外，米根霉中表达了黑曲霉的木聚糖酶编码基因（木聚糖酶） 。从 GFP 得到的载体的表达包含源于磷酸激酶1（PGK1） ，丙酮酸脱羧酶（PDCA） ，糖化酶（

20、amyA）的三个不同的启动子元件。在这些启动子元素中，PDCA 启动子给了最强的信号，并被选定为所有表达启动子元素的现代构造描述。分析 GFP 表达转化体是，发现当荧光信号是存在于一个连字符，它没有集中在一个特定的细胞器或菌丝顶端，而是均匀地分布。这些转化转录分析后，得出的结论是，转录水平和 GFP 的堆积有明确的相关性。有趣的是，该基因的拷贝数没有显着影响蛋白的积累。基 因 剔 除通过导入基因生产新的酶，接着 DNA 也被引进来建立基因淘汰。随着双交换事件，基因被淘汰，因此，可以研究代谢途径中基因功能或效果的特定损失。目前，米根霉中详细描述双交叉事件成功的的唯一的例子是高亲和力铁通透酶编码基

21、因（FTR1） 。此基因宿主感染过程中在米根霉中强烈表达，体现了 FTR1在米根霉的致病性中的作用。为了研究 FTR1的作用，来自99-880米根霉的营养缺陷型突变体成功形成了双交换同源重组的基因敲除。在所产生的转化体中，FTR1编码基因在非选择性条件下未检测到。然而，选择压力下，推定的 FTR1无效突变体的表型效应丢失，再次检测到 FTR1编码基因。选择性条件下，米根霉的多核性质胜过了 ftr1无效突变体的表现型。经过连续14个以上的孢子形成和在非选择性条件下单菌落接种，通过 PCR 分析未检测到该基因。然而，在选择性培养基中生长48小时内，该基因被再次通过 PCR 进行扩增。据推测，ftr

22、1编码基因可能必需存在于贫铁培养基中，因此，不可能得到其无效突变体。此外，在本文中，在这个菌株中有可能获得咪唑甘油磷酸脱氢酶（HIS3）无效突变体，虽然这些数据没有公布。RNA 干扰 另一种降低基因表达的优良方法是 RNA 干扰（RNAi） 。RNA 干扰是一种新近发现的双链 RNA 触发核糖核酸（mRNA）信使的同源序列降解的机制。其结果是，减少或取消相应的蛋白质的翻译。RNA 干扰机制，几种蛋白质是必需的：一个dicer 酶，Argonaut 蛋白，以及依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRP 的） 。内切酶把双链 RNA 切割成双链的短干扰 RNA（RNA 干扰） 。argonaut

23、蛋白随后与干扰 RNA片段结合，并保留单链 RNA。argonaut 蛋白复合物识别 mRNA 的同源序列，从而使 mRNA 不能翻译成蛋白质.RdRP 识别切割的 mRNA 链，这将产生更多的siRNA，从而引起严重的回应。对于真菌，通过发夹 RNA 形成高效稳定的 RNA 干扰。此外，合成的 siRNA 相继出现会引发的 RNAi 的回应。有人预测，基于99-880米曲霉菌株的基因组序列，含有两个 Argonaut 蛋白拷贝，一个 dicer 酶，和五个 RdRP 的编码基因。在同一研究中，研究高亲和力铁通透编码基因（FTR1）的作用，并利用 RNA 干扰沉默基因及研究其作用。ftr1基因

24、通过间隔元件保持分开的正义和反义（450个基点）产生的一个结构。 转录后的构建，启动 RNAi 的过程形成一个发夹结构（hpRNA） 。沉默基因用该方法取得成功，并用此构造产生的转化体的铁的吸收减少了大约50。此外，对小鼠的致病性大大降低。将转化体用于感染小鼠，并重新从死于感染的小鼠和健康小鼠中分离出来。发现感染的死小鼠中的转化体已经失去了 RNAi 载体，但在健康人群中，载体仍然存在。类似于 hpRNA 干扰，siRNAs 的成功的用于 LDHA 基因和 LDHB 基因的沉默。这些基因的沉默，以减少了丙酮酸流向 L-（+）-乳酸，从而提高了乙醇形成。因此，在 LDHA 编码基因区域中设计了合

25、成 siRNA，它与 LDHB 基因有高度的序列相似性。siRNAs 有25个核苷酸长，用于改造米根霉 CCUG28958产生的原生质体。总共隔离出6个组合式转化体并在含有30g / L 的 D-葡萄糖的培养基中生长。组合式转化体的平均 L-（+）-乳酸产量为0.01克/克 D-葡萄糖，这表示与亲本株0.07克/克的产率相比减少了86。乙醇产量从0.39至0.45克/克平均增加15。组合之后，甘油，琥珀酸盐，和丙酮酸盐的产率增加而生物量生产减少。siRNA 基因沉默的效果是短暂的，因此不适合用于工业过程。这两项研究的结果表明，RNAi 可以有效地用于基因表达的下调。最后，它是可以通过随机诱变和

26、转基因改变米根霉菌株的基因组。异源基因表达的关键是难以获得基因组整合的 DNA 载体 。此外，有多种营养缺陷型标记条件的缺乏和显性选择标记。因此，需要进一步的研究米根霉的利用的潜力，来进行平台化学品的生产。 主发酵产品的途径 米根霉中主要发酵产物途径由丙酮酸彼此连接。在米根霉，所有发酵的碳源都代谢成丙酮酸。丙酮酸随后进入一些途径，如负责发酵终产物的形成途径。这个结点被命名为丙酮酸的分支点。培养基中溶解氧影响丙酮酸分支点的流向。（微）厌氧条件下，碳源反应生成的乙醇，而在有氧条件下，过量的碳源时，流向有机酸的形成。这种现象在使用含70g/L 的 D-葡萄糖的旋转纤维床反应器的研究中清楚得到证实。最

27、高的乙醇产率（理论产率的37）是在20的溶解氧（DO）的条件下得到的。后增加至25和50，乙醇理论产率下降到26和15。这些结果也演示了含有70g/L 的 D-葡萄糖搅拌釜式生物反应器的使用。在低的转速条件下乙醇的最高产率超过理论产率的50。搅拌或增加曝气量后的产量还会下降。乙醇发酵途径允许在缺氧的情况下，短时间内生长。有机酸的生产认为是高糖浓度的溢出机制的结果，因为细胞到环境样本中不会遇到这些高浓度。乙醇生成途径在丙酮酸脱羧酶（PDC）和乙醇脱氢酶（ADH）的联合作用下，催化丙酮酸生成乙醇。NRRL395米根霉，检测到两个 PDC-编码基因，在非发酵碳源甘油的存在下这是不表达的，但加入 D-

28、葡萄糖后，很容易表达。此外，缺氧条件下增加了这些基因的转录水平。在厌氧和好氧条件下比较 PDC 的活性，在厌氧条件下，酶的活性强大约3倍。虽然在 PDC 活性和编码基因得到一些认识，但是 ADH酶的性子和编码基因也做些工作。 与 NRRL395米根霉在厌氧条件下生长相比，有氧条件下 ADH 活性高约7倍。此外，II 型菌株似乎比 I 型株产生更多的乙醇。这可能是 L-（+） - 乳酸形成途径缺陷的原因。在发酵过程中，碳源被代谢为丙酮酸。丙酮酸库分布在许多途径中。可以假设当一个途径是不存在的，可对剩余的途径提供更多丙酮酸，因此在富含碳的环境中增加乙醇量的形成。L-（+） - 乳酸途径在有氧条件下

29、，发酵的主要产物是有机酸，可能由于 PDC 和 ADH 的基因的表达的下调。L-（+） - 乳酸是一个单一酶步骤产生的，由 NAD+ - 依赖型 L乳酸脱氢酶催化丙酮酸产生的。在基因枪法转化系统的帮助下，可能进一步的了解产生 l-（+） - 乳酸背后的分子机制。在 II 型菌株99-880米根霉衍生的营养缺陷型突变体中引入 I 型菌株 NRRL395米根霉的 LDHA 编码基因。生成的转化体将25以上的初始 D-葡萄糖转换 L-（+） - 乳酸的，而受体菌株不产生任何 L-（+） - 乳酸。L- （+） - 乳酸生产的这种增加被耦合到延胡索酸和乙醇生物量形成的减少，从而使丙酮酸流定向从丙酮酸分

30、支点的其他产品走向 L-（+）- 乳酸。为了进一步研究 L-（+） - 乳酸形成的分子机制，供体和受体菌株的 LDHB 编码基因在大肠杆菌中表达。酶解分析，两个纯化 LDHB 蛋白质的演示发现 NADH 是利用丙酮酸生成 L-（+） - 乳酸的辅酶。然而，未转化的 II型菌株不能产生任何 L-（+）- 乳酸。据推测，不能进行 L-（+） - 乳酸生产是严紧的转录调控所造成。Northern 印迹分析，没有检测到 LDHB 转录，更敏感的 RT-PCR 方法才能检测到基因转录。转录量非常低可能是导致为什么一些II 型菌株能够产生少量的 L-（+）- 乳酸的原因。延胡索酸和 l-（+） - 苹果酸

31、的产生途径从丙酮酸分支点起始的其他发酵产物是延胡索酸和1 - （+） - 苹果酸。这些有机酸生产主要通过位于细胞质中的还原性三羧酸（TCA）循环。 这一途径的第一个酶是分布在细胞质中的丙酮酸羧化酶（PYC） 。在真核生物中，这种酶是通常只出现在线粒体中。PYC 是生物素依赖酶并将丙酮酸羧化成草酰乙酸。为了充分将丙酮酸转换升-（+） - 苹果酸和延胡索酸，位于细胞质中的其他两个酶也是必需的。苹果酸脱氢酶（MDH）将草酰乙酸转换成 L-（+） - 苹果酸，并在延胡索酸酶（FUM）的作用下水合（可逆）成延胡索酸。延胡索酸随后运输穿过细胞膜。研究米根霉中延胡索酸的生产中所涉及的酶，最好是 FUM 酶。

32、据弗里德伯格等在 Northern 杂交和引物延伸分析的基础上推测，米根霉有一个基因编码FUM 酶。然而，位于细胞质和线粒体中的酶的反应动力学是不同的。酶动的反应力学的不同可能是由于区室的不同条件或翻译后的修饰。这在真核生物中是常见的，如大鼠中胞浆和线粒体酶来源于同一基因。然而，Goldberg 等人建认为，在细胞质和线粒体中有两个基因编码 FUM 酶。为了确定哪个假设是正确，克隆了 NRRL1526米根霉 DNA 基因组中延胡索酸酶基因， 它产生一个单一的转录物。产生的抗血清防止酿酒酵母中 FUM 酶部分中和米根霉的无细胞提取物中酶的活性。为了确定是否不同延胡索酸酶是出现在不同的生长阶段，测

33、定生长阶段和产酸阶段的菌丝体的无细胞提取物中酶的活性。生长阶段菌丝 FUM 的 K m 为0.78毫摩尔的延胡索酸，2.9毫摩尔 L 的 L-（+）-苹果酸。延胡索酸的存在不抑制延胡索酸酶的活性。然而2毫摩尔 L-1的延胡索酸的存在完全阻断产酸菌丝体中的 FUM 酶活性。作者表示，这可能是在产酸条件诱导产生一个独特 FUM酶。这种酶将产生延胡索酸，而且逆反应完全阻断延胡索酸量的增加。作者曾试图获得这种独特的 FUM 酶，它的半衰期是2小时。由弗里德伯格等克隆的基因没有进一步的特征。当在新鲜的培养基中接种生长前期生物时，观察到延胡索酸生产在酸性条件中延迟，表明存在两个不同的基因。为了进一步阐明延

34、胡索酸酶的假说，Song 等人克隆了 ATCC20344米根霉的 FUM 酶的编码基因序列。基因在大肠杆菌中表达并分析相应酶。得出的结论是 FUM-编码基因负责生产延胡索酸。L-（+）- 苹果酸的 K m 为0.46毫米，当延胡索酸浓度超过2毫米时阻止延胡索酸反应生成 L-（+）- 苹果酸。这些与 Battat, Pines, and Goldberg等人未发表的结果是相同的。Song 等人同时比较 fumR 序列并确定它们在 N 末端的15个氨基酸的氨基酸序列的异常是相同。该氨基酸序列的存在可能是负责酶的固定和酶的活性。然而，作者认为，需要额外的测试，以确定这个假设是否是正确的。Goldbe

35、rg 和宋 Song 等人认为米根霉生产的特殊延胡索酸是由 FUM 酶在高浓度延胡索酸中不可逆的催化反应所造成的。然而，L -（-）- 苹果酸转化成延胡索酸的 G0是3.6千焦/摩尔表明，在平衡状态下，L - （+） - 苹果酸的浓度高于延胡索酸浓度。这表明，米根霉生产延胡索酸过程中，对延胡索酸具有高选择性的二羧酸转运蛋白也起着重要的作用。米根霉生长在发酵罐中在低的 pH 值（3.0）时，细胞本身的延胡索酸产率比较高的 pH 值（5.0）时低。这可以解释为增加能量需求，以保持内部的 pH 值，从而导致更多的葡萄糖转化为 CO2和少量的延胡索酸。结论及未来前景随着平台化学品需求的增加，原材料成本

36、的增加，以及可持续发展的要求不断增长的需求，需要高效的生物催化剂。这些生物催化剂部分是靠丝状真菌米根霉来生产。这种微生物能够生产乙醇，L-（+） - 乳酸和延胡索酸，并且具有生产延胡索酸能力的基因部分来自于其他真菌属。这些平台化学品的生产上在各种各样的碳源上收率都高，L-（+） - 乳酸和乙醇的理论产率超过85及延胡索酸的理论产率超过65。在细胞中，所有的代谢终产物具有一个共同的丙酮酸池，并且这些产品的形成途径是已知的。现在，代谢工程技术能够进一步提高产量。这些技术包括 RNA 干扰，随机诱变，基因敲除策略。此外，它是目前可能引入异源基因，从而引起新产品的形成，最终引入到全部途径中。为了实现多

37、个基因的引进，应当研究主体和多种营养缺陷型的选择标记。应该联合其他的研究，以获得引入细胞中 DNA 命运的进一步了解，尽管它很少整合到基因组中。虽然可以改变基因组，并引入异源 DNA，但是米根霉的基因组本身也形成了一个有趣的酶源。例如引进酿酒酵母中的 FUMR 编码基因生产延胡索酸，LDHA在酿酒酵母中表达生产乳酸，米根霉的脂肪酶在毕赤酵母和酿酒酵母中表达。米根霉这种微生物是一种多用途的生物体，已经被广泛运用。预计，由于上述原因，这将继续增加。致谢这个项目是由 SenterNovem 公司（荷兰乌得勒支）提供赞助（EOSLT02034） 。利益冲突作者宣称，他们没有利益冲突。打开访问这篇文章是在 Creative Commons Attribution License 条款下发表的，允许任一媒体使用，发表和再现，提供原作者和来源计入。