1、第一章氨基酸科学故事：第二十二种标准氨基酸生物学家因发现新的氨基酸带来的喜悦不亚于物理学家发现了新的粒子或化学家发现了新的元素。1986 年以前，人们一直认为，出现在蛋白质分子中的由遗传密码编码的标准氨基酸残基只有 20 种。到了 1986 年，科学家们终于在含硒蛋白中发现第二十一种标准氨基酸含硒半胱氨酸。时隔 16 年之后，来自美国俄亥俄州立大学的两个研究小组在产甲烷细菌里发现了第二十二种标准氨基酸吡咯赖氨酸。俄亥俄州立大学由 Joseph A. Krzycki 领导的研究小组一直在研究一种属于古细菌的产甲烷微生物巴氏甲烷八叠球菌（ Methanosarcina barkeri）。此微生物能
2、够将单甲胺（monomethylamine）、二甲胺（dimethylamine）和三甲胺（trimethylamine）转变成甲烷。1995 年，Krzycki 的研究小组分离得到一些与甲烷生成有关的特殊蛋白质。两年以后，他们分离得到编码其中一个蛋白质的基因，并测定出了它的核苷酸序列。1998 年，他们发表了这个基因的全序列，结果显示其阅读框架内含有一个反常的琥珀型终止密码子（amber codon）。密码子是决定氨基酸的三字母核苷酸序列（参看“第三十八章蛋白质的生物合成与细胞内降解”），琥珀型终止密码子的核苷酸序列是 TGA，它通常不决定任何氨基酸，它的出现一般是多肽链合成结束的标志。然而
3、，让 Krzycki 吃惊的是 ，该终止密码子竟然编码一种氨基酸，而且这种奇怪的现象还出现在其他几种与甲烷产生有关的基因上。与此同时，由 Michael Chan 领导的研究小组开始研究由琥珀密码子编码的氨基酸的结构。他们意识到这个古怪的密码子也许编码一种新的氨基酸，但也有其他的可能性。Krzycki 及其同事决定测定原来蛋白质的氨基酸序列。当得到蛋白质的氨基酸序列以后，他们发现由琥珀密码子决定的氨基酸似乎仅仅是一个赖氨酸。但是，Krzycki 仍然要求 Chan 和他的一个博士研究生 Bing Hao 对含有这个氨基酸的蛋白质晶体结构进行研究以确定那个氨基酸的性质。经过两年的研究，Chan
4、和 Hao 终于确定了这个蛋白质的结构。他们得到的一些数据表明那个氨基酸是一个新的氨基酸。不仅如此，Krzycki 还在寻找其他证据。他和他的博士研究生 Gayathri Srinivasan、Carey James 很快发现了一种新的特异性 tRNA专门负责将新的氨基酸插入到蛋白质之中，同时还发现其他一些与此过程有关系的酶。综合以上两个发现以及更为详细的晶体结构，他们确信他们发现了第二十二种由 DNA 编码的氨基酸吡咯赖氨酸。他们还认为，这个新的氨基酸是一个非常罕见的氨基酸，所以这么多年后才被发现。然而，Krzycki 相信它也可能存在于其他有机体内。对此 Chan 表示同意并指出，发现第二
5、十二种氨基酸将激励更多的研究者去寻找第二十三种乃至第二十四种氨基酸。随着更多种生物的基因组序列被破译，有理由认为某些有趣的事情迟早会发生。 小结氨基酸是一类同时含有氨基和羧基的有机小分子。组成多肽和蛋白质的氨基酸除Gly 外，都属于 L 型的 - 氨基酸（Pro 为亚氨基酸）。氨基酸不仅可以作为寡肽、多肽和蛋白质的组成单位或生物活性物质的前体，也可以作为神经递质或糖异生的前体，还能氧化分解产生 ATP。目前已发现蛋白质氨基酸有 22 种，其中 20 种最为常见，而硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸比较罕见。非蛋白质氨基酸通常以游离的形式存在，作为代谢的中间物和某些物质的前体，具有特殊的生理功能。22 种标
6、准氨基酸可使用三字母或单字母缩写来表示。某些标准氨基酸在细胞内会经历一些特殊的修饰成为非标准蛋白质氨基酸。氨基酸有多种不同的分类方法：根据 R 基团的化学结构和在 pH7 时的带电状况，可分为脂肪族氨基酸、不带电荷的极性氨基酸、芳香族氨基酸、带正电荷的极性氨基酸和带负电荷的极性氨基酸；根据 R 基团对水分子的亲和性，可分为亲水氨基酸和疏水氨基酸；根据对动物的营养价值，可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。氨基酸的性质由其结构决定。其共性有：缩合反应、手性（Gly 除外）、两性解离、具有等电点，以及氨基酸氨基和羧基参与的化学反应，包括与亚硝酸的反应、与甲醛的反应、Sanger 反应、与异硫氰酸苯酯的反
7、应和与茚三酮的反应等。与亚硝酸的反应可用于 Van Slyke 定氮，与甲醛的反应可用于甲醛滴定，Sanger 反应和与异硫氰酸苯酯的反应可用来测定 N-端氨基酸。只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，其余生成蓝紫色物质，利用此反应可对氨基酸进行定性或定量分析。多数氨基酸的侧链可能发生特殊的反应，可以此鉴定氨基酸。不同氨基酸在物理、化学性质上的差异可用来分离氨基酸，其中最常见的方法是电泳和层析。第二章 蛋白质的结构科学故事：一级结构决定高级结构蛋白质的高级结构由其一级结构决定的学说最初由 Christian B. Anfinsen 于1954 年提出。在 1950 年之前，Anfins
8、en 一直从事蛋白质结构方面的研究。在进入美国国立卫生研究所（NIH）以后，继续从事这方面的研究。当时他最想知道的是：一个蛋白质是如何折叠成它独特的三维构象的？需不需要其他酶的帮助？蛋白质为什么要采取特定的构象？Christian B.Anfinsen然而，要想了解蛋白质的折叠过程，首先需要建立一种方法能够测量或评估蛋白质的构象，其次还需要找到一种手段用以检测折叠过程。Anfinsen 以牛胰核糖核酸酶（ribonuclease）为研究对象轻而易举地解决了第一个问题（实际上选用此酶的部分原因是当时的芝加哥肉类加工公司能够为他的实验室随时提供足够的原材料），因为核糖核酸酶催化 RNA 的水解，其
9、酶活性完全取决于其特定的三维构象，于是酶活性成为测量这种蛋白质采取何种构象的一种方法。但要观测折叠过程既可以从一个新合成的尚没有折叠的蛋白质开始，也可以在体外将一个已折叠好的蛋白质去折叠（unfold），然后再观察它的再折叠（refold）过程。Anfinsen 选择了后一种途径。事实上，这种酶特别适合用后一种途径进行研究，首先因为二硫键是决定其分子形状的主要因素。另外，此酶是一种单纯蛋白质，只有 124 个氨基酸残基组成，含有 4 个二硫键，而且其活性很容易通过测定水解 RNA 释放出来的核苷酸量来测定。Anfinsen和两个博士后 Michael Sela、 Fred White 在研究中
10、发现，使用高浓度的巯基试剂- 巯基乙醇（ - mercaptoethanol）可将二硫键还原成自由的巯基，如果再加入尿素，进一步破坏已被还原的核糖核酸酶分子内部的次级键，则该酶将去折叠转变成无任何活性的无规卷曲。对还原的核糖核酸酶的物理性质进行分析的结果清楚地表明了它的确采取的是无规卷曲的形状。在成功得到一种去折叠的核糖核酸酶以后，Anfinsen 着手开始研究它的重折叠过程了。考虑到被还原的核糖核酸酶要在已被还原的 8 个 Cys 残基上重建 4 对二硫键共有 105 种不同的组合，但只有一种是正确的形式，如果决定蛋白质构象的信息一直存在于氨基酸序列之中，那么，最后重折叠得到的总是那种正确的
11、形式。否则，重折叠将是随机的，最后只能得到少量的正确形式。显然，第一种情形能完全恢复去折叠过程中丧生的酶活性，而后一种情况只能恢复很少的酶活性。 Anfinsen 的重折叠实验还是比较顺利的，他通过透析的方法除去了导致酶去折叠的尿素和巯基乙醇，再将没有活性的酶转移到其生理缓冲溶液之中，在有氧气的情况下于室温放置，以使巯基能重新氧化成二硫键。经过一段时间以后，发现核糖核酸酶活性得以恢复，这意味着它原来的构象恢复了（图 2-47）。由于上述过程没有细胞内任何其他成分的参与，完全是一种自发的过程，因此，有理由相信此蛋白质正确折叠所需要的所有信息全部存在于它的一级结构之中。很快，Anfinsen 的研
12、究成果被发表在 1954 年 生物化学杂志（Journal of Biological Chemistry，JBC）上。进一步的实验确定了变性的核糖核酸酶完全恢复其活性的条件，在此基础上，Anfinsen 提出了蛋白质折叠的热力学假说（thermodynamic hypothesis）。根据此假说，一个蛋白质的天然三维构象对应于在生理条件下其所处的热力学最稳定的状态。热力学稳定性由组成的氨基酸残基之间的相互作用决定，于是蛋白质的三维构象直接由它的一级结构决定。图 247 牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验尽管 Anfinsen 的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基础，他也因此获得了 1972 年的诺贝
13、尔化学奖，但是蛋白质折叠是相当复杂的。到现在为止，我们仍然不能根据一个蛋白质的一级结构推断出它的三维结构。同时，还必须注意到，蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要慢得多！肽是氨基酸之间以肽键相连的聚合物，它包括寡肽、多肽和蛋白质。氨基酸是构成肽的基本单位。线形肽链都含有 N 端和 C 端，书写一条肽链的序列总是从 N 端到 C端。肽键具有部分双键的性质，多为反式，也有顺式。酰胺平面中 C -N 单键旋转的角度称为 ，C -C 单键旋转的角度称为 。 和 决定了相邻两个肽单位在空间上的相对位置。210 个氨基酸残基组成的肽为寡肽，1250 个氨基酸残基组成的肽为多肽，由50 个以上的氨基酸残基组
14、成的肽通常被称为蛋白质。天然存在的活性肽有的是在核糖体上合成，有的在核糖体以外的地方由特定的酶依次催化而成。寡肽的理化性质包括两性解离、双缩脲反应等。蛋白质的结构一般包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，二级结构、三级结构和四级结构被称为高级结构，一种蛋白质的全部三维结构一般被称为它的构象。蛋白质的一级结构是指氨基酸在多肽链上的排列顺序，含二硫键的蛋白质的一级结构还包括二硫键的数目和位置。蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架本身在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。常见的二级结构有 螺旋、三股螺旋、 折叠、 转角、 凸起和无规卷曲。 螺旋中肽链骨架围绕一
15、个轴以螺旋的方式伸展，它可能是极性的、疏水的或两亲的。 折叠是肽链的一种相当伸展的结构，有平行和反平行两种。如果 股交替出现极性残基和非极性残基，那么就可以形成两亲的 折叠。 转角指伸展的肽链形成 180的 U 形回折结构而改变了肽链的方向。凸起是由于 折叠股中额外插入一个氨基酸残基而形成的，它也能改变多肽链的走向。无规卷曲是在蛋白质分子中的一些极不规则的二级结构的总称。无规卷曲无固定走向，有时以环的形式存在，但不是任意变动的。从结构的稳定性上看，右手 螺旋 折叠 U 型回折无规卷曲，但在功能上，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当， 右手螺旋和 折叠一般只起支持作用。蛋白质的三级结构是指多
16、肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。三级结构通常由模体和结构域组成。稳定三级结构的化学键包括氢键、疏水键、离子键、范德华力、金属配位键和二硫键。模体可用在一级结构上，特指具有特殊生化功能的序列模体，也可被用于功能模体或结构模体，相当于超二级结构。结构模体是结构域的组分，基本形式有、 和 等。常见的模体包括：左手超螺旋、右手超螺旋、卷曲螺旋、螺旋束、 螺旋-环- 螺旋、Rossmann 卷曲和希腊钥匙模体。结构域是在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块，由若干个结构模体组成的相对独立的球形结构单位，它们通常是
17、独自折叠形成的，与蛋白质的功能直接相关。一个结构域通常由一段连续的氨基酸序列组成。根据其占优势的二级结构元件的类型，结构域可分为五大类： 结构域、 结构域、/ 结构域、+结构域、交联结构域。以上每一类结构域的二级结构元件可能有不同的组织方式，每一种组织就是一种结构模体。这些结构域都有疏水的核心，疏水核心是结构域稳定所必需的。确定一个蛋白质的三级结构的方法有 X 射线晶体衍射和 NMR。可以用不同的模型来展示蛋白质的三维结构，常见的模型有：线框模型、球棍模型、棍式模型、空间填充模型、骨架模型和丝带模型。具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。组成寡聚蛋白质或多聚蛋白质的每
18、一个亚基都有自己的三级结构。蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。驱动四级结构形成或稳定四级结构的作用力包括氢键、疏水键、范德华力和离子键。具有四级结构的蛋白质具有特殊的优势，不适当的四级结构的相互作用会影响到某些蛋白质的功能。蛋白质是高度柔性的分子，其柔性是生物功能所必需的。三级结构的柔性允许蛋白质适应它们的配体。蛋白质柔性随着功能的不同而不同，并不是所有的蛋白质的柔性都一样。蛋白质折叠的基本规律包括：一级结构决定高级结构；蛋白质的折叠伴随着自由能的降低，但是并不通过随机尝试找到自由能最低的构象；是协同和有序的过程；绝大多数需要分子伴侣的帮助。某些蛋白质的
19、折叠还需要蛋白质二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶的帮助。蛋白质折叠经过启动过程形成结构域，再经熔球态中间体最终形成完整的三维结构。蛋白质在溶液中折叠的驱动力有：肽链内的氢键释放水，增加水的熵；疏水侧链倾向聚合以尽可能减少与水接触的疏水面积；亲水残基面向表面与水接触，增加溶解性。细胞内错误折叠的蛋白质来不及处理就可能导致机体的病变。与蛋白质错误折叠相关的疾病有阿尔茨海默病、帕金森病和牛海绵状脑病等。蛋白质高级结构可以通过预测来进行研究。与预测蛋白质的三级结构相比，二级结构的预测要容易一些，因为 20 多种标准氨基酸残基具有形成不同二级结构的倾向。对于两种主要的二级结构而言， 螺旋可被视为多肽链的默
20、认二级结构状态，因为 螺旋与 折叠相比具有熵的优势。目前使用从头计算法预测三维结构还很不成功。获得一种蛋白质精确的三级结构仍然需要借助于 X 射线衍射和 NMR。可以对蛋白质单独进行功能预测或者与结构预测结合起来。第三章 蛋白质结构与功能的关系科学故事：一种多功能蛋白质的发现以前分子生物学里有一个基本观点，就是一个基因决定一条多肽链，而一条多肽链只具有一种特殊的功能。但随着分子克隆技术的发展，越来越多已知活性的蛋白质及其基因被克隆、测序和比对以后发现，蛋白结构与活性之间不再是个单纯的一对一的关系了。1987 年，芬兰 Oulu 大学的 Pihlajaniemi 在研究人体胶原蛋白的时候就发现了
21、这样的例外。Taina Pihlajaniemi胶原蛋白是人体中含量最多的蛋白质，其二级结构是由三条相同的多肽链互相缠绕而成的三股螺旋，每条肽链上含有多个 GlyXY 重复序列，其中 X 位置主要是 Pro，Y 位置主要是羟脯氨酸（Hyp）。胶 原 蛋 白 三 股 螺 旋 结 构 的 稳 定 性 与 Y 位 置 上 脯 氨 酸 有 多 少 被 羟 基 化有 关 ， 因 此 ， 催 化 Pro 羟 基 化 的 脯 氨 酸 羟 化 酶 （prolyl-4-hydroxylase ）是决定胶原蛋白稳定性的一个十分重要的酶。脊椎动物的这个酶是由 2 个 基和 2 个 亚基组成的四聚体。 亚基和 亚基分
22、别由不同的基因编码。不论 或 亚基，单独都没有活性，但 亚基的单克隆抗体能使整个酶失去活性，而只有 和 亚基同时存在的时候，酶才能与它的辅助因子抗坏血酸结合，这说明 亚基的确是表现酶活性的重要组成部分。但奇怪的是， 及 亚基在细胞内的表达并不一致。 亚基的数量远远高于 亚基，因此 亚基合成后立刻会与 亚基结合成有活性的脯氨酸羟化酶，而留下许多单独存在的 亚基。那么单独的 亚基会有其他的功能吗？既然蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构，而蛋白质的高级结构又决定它的功能，那么如果知道了一种蛋白质的一级结构，不仅可以预测和解释这个蛋白质的高级结构和功能，同时还可以将这个蛋白与其他已知功能的蛋白质进行
23、序列比对，从而有可能发现新的功能。Pihlajaniemi 在得到脯氨酸羟化酶 亚基的一级结构以后，也将它的氨基酸序列输入计算机，在互联网上和其他已知的蛋白质的氨基酸序列进行比对。出乎意料的是，她发现人类脯氨酸羟化酶 亚基中 94%的氨基酸与小鼠的蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）相同。她用纯化的 亚基也检测到它的确有 PDI 的酶活性，再用克隆的 亚基的 cDNA 作探针，发现人类细胞中只有一个基因具有类似的碱基序列。因此 PDI 很可能就是单独的脯氨酸羟化酶的 亚基。换句话说，一个基因表达出来的蛋白质在不同的条件下可以同时具有两种完全不同的
24、酶活性。PDI 早在 1963 年就在鼠肝和胰腺组织中被发现，其主要功能是催化蛋白质上二硫键的交换反应，具有较广的底物特异性。PDI 在体外能够促进被变性和还原的含有二硫键的蛋白质（如胰岛素、溶菌酶、核黄素结合蛋白和抗体等）重获活性。当一个蛋白质的天然构象遭尿素破坏，而其二硫键也被还原剂打破以后，若要恢复这个蛋白质原来正确的构象，不仅要除去尿素，同时还要让二硫键重新形成，并恢复到原来正确的连接，PDI 就可以加速这个“尝试错误、发现正确”的过程。但 PDI 在人体内是否也扮演同样的角色则仍是未知数。有了这个后知之明，再去看 PDI 在体内分布的情形，发现 PDI 的活性主要集中在内质网，这很容
25、易让人们想起它可能在分泌蛋白折叠过程中起作用，因为许多分泌蛋白都含有二硫键。而后来的许多研究证明，PDI 的确就具有这种功能。那么， 亚基的功能是不是就到此为止了呢？1991 年，J. R. Wetteran 等使用氨基酸序列分析和免疫化学分析发现一种由大小两个亚基组成的微粒体三酰甘油转移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTP）的小亚基与脯氨酸羟化酶的 亚基一模一样。但 MTP 的 PDI 酶活性仅是自由 PDI 的十分之一。后来又有人发现，单独的 亚基在细胞内还充当甲状腺素结合蛋白（thyroid hormone binding pro
26、tein,THP ）。迄今为止，已经发现了许多多功能蛋白，像哺乳动物的脂肪酸合酶居然具有 7 种酶活性外加一种酰基载体蛋白的功能。多功能蛋白质的存在不仅可以提高基因的编码功能，而且还可能有利于对蛋白质的活性进行调控。小结蛋白质可视为生物功能试剂，几乎每一项细胞活动都牵涉到一种或多种特定的蛋白质。蛋白质的主要功能包括分子识别、酶、分子开关和结构支持。分子识别是蛋白质功能的中心。配体与蛋白质的特异性结合受到形状、互补性和极性相互作用的控制。蛋白质表面大分子配体的结合位点可能是凹陷、突起或“平地”；小分子配体的结合位点是裂缝、口袋或空穴。蛋白质和配体结合的亲和力主要归于无方向性的疏水作用，结合的特异
27、性主要归于具有方向性的力，如氢键。蛋白质的功能由其特定的三维结构决定。每一种蛋白质都具有特定的结构和特定的功能，高级结构决定其功能。蛋白质的一级结构决定其高级结构和功能，一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。功能相似的蛋白往往在进化上具亲缘关系，一级结构相似的蛋白质往往具有共同的起源。许多疾病是由相关的蛋白质结构异常引起的。纤维状蛋白质由几条肽链铰合而成，难溶于水，它们倾向于形成规则的长的曲线结构，这是由其一级结构的高度规律性决定的。它们的主要功能是在结构或机械上，为生物体提供坚实的支架。-角蛋白来源于动物的毛发、角、鸟喙和爪子。每一个 -角蛋白分子在其中央形成典型的 螺旋，而两端为非螺旋区。两
28、个 -角蛋白分子通过疏水的 R 基团的结合，相互缠绕形成双股的卷曲螺旋，这大大地提高了 螺旋的稳定性。链间形成的多个二硫键还可进一步提高 -角蛋白的强度。-角蛋白主要来源于蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白，其一级结构具有重复序列GlyAla/SerGlyAla/Ser；二级结构主要是反平行 折叠。Gly 和 Ala/Ser 分别分布于折叠片层的两侧，使得相邻的 折叠更加紧密地堆积形成网状结构，赋予蛛丝较高的抗张强度，同时 螺旋又赋予蛛丝一定的柔软性。相邻的 角蛋白之间无共价交联。胶原蛋白是动物细胞外基质的一种成分，其基本组成单位是由 3 条 链组成的原胶原分子。原胶原的一级结构具有重复的 GlyXY
29、三联体序列。X 和 Y 通常是 Pro。胶原蛋白富含 Gly 和 Pro 的性质使得它难以形成 螺旋，但有规律重复的三联体序列促进三条胶原蛋白链之间形成三股螺旋。球状蛋白质的结构与功能要比纤维状蛋白复杂。属于球状蛋白的珠蛋白家族都含有血红素辅基，都能够可逆地结合氧气，都含有珠蛋白折叠这样的结构模体。属于这一类家族的有 Mb、Hb、Ngb 和 Cygb。Mb 存在于肌肉中，其功能主要是贮存和运输 O2，此外还能解除 NO 的毒性。Mb 的分子表面形成一个深的疏水口袋，血红素 “藏”在洞中。该口袋允许 O2进入而阻止H2O 的进入，既保证了 Fe2+结合 O2又可防止 Fe2+的氧化。Mb 的氧合
30、曲线是双曲线，这使得它倾向于结合 O2而非释放 O2，只有在 pO2极低的时候才释放出 O2。Hb 存在于红细胞，其功能是运输氧气。Hb 由四个亚基组成，每个亚基的一、二和三级结构与 Mb 相似。Hb 氧合曲线因为它与 O2结合具有正协同效应而呈 S 形，只有在pO2很高的情况下 Hb 才结合氧气，而 pO2一旦降低，它就释放 O2。Hb 的正协同效应是指 Hb 分子中一个亚基结合 O2后，可以导致其构象发生变化，使其他亚基对 O2的亲和力突然增强。可使用 Hill 系数对 Hb 的正协同效应进行评估： n =1，无协同效应； n 1，为正协同效应 ； n 1，为负协同效应。H+、CO 2和
31、2，3-BPG 等小分子配体对 Hb 的氧合也产生影响。其中 H+和 CO2促进 Hb释放 O2，这样的效应被称为波尔效应。2，3-BPG 可与脱氧 Hb 上的位于两条 亚基之间的带正电荷的空洞结合，稳定 T 态，显著降低 Hb 与 O2的亲和力，促进 Hb 在组织中释放 O2。HbS 是 Hb 的突变体，它直接导致镰状细胞贫血。HbS 导致溶血的原因在于其 亚基的 Glu6 突变成 Val6 以后，HbS 由于疏水键而聚集在红细胞表面使细胞膜破裂。Ngb 和 Cygb 是近期发现的珠蛋白，Ngb 主要在脊椎动物的大脑和视网膜细胞中表达，Cygb 几乎在脊椎动物所有的细胞和组织中都能表达。与
32、Mb 和 Hb 不同的是，Ngb和 Cygb 的血红素辅基上的铁在没有氧气结合的时候，已有 6 个配位键，故 O2或其他配体需要取代 HisE7 形成的配位键后才能与血红素结合。此外，Ngb 和 Cygb 含有链内二硫键。Ig 是一类由 B 淋巴细胞分泌的糖蛋白，可与特异的抗原结合而激发特定的免疫反应。Ig 由 2 条重链和 2 条轻链组成，分子内有大量的二硫键。多肽链分为 C 区和 V 区。IgG 的二级结构几乎全是 折叠，由无规卷曲连接。IgG 的三级结构由 12 个球形结构域组成，每个均被二硫键锁住。抗体在结合抗原的前后，其构象从 Y 型变成 T 型。生物膜的各种功能是由各种结构不同的膜
33、蛋白完成的。膜蛋白可分为外周蛋白、内在蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白与非膜蛋白含有相同的二级结构元件，其中 螺旋是最常见的二级结构， 折叠也时有发现。目前常使用的功能预测法主要包括：基于序列的途径、基于结构的途径、结构与序列比对法、基于模体的方法和基于“连坐”的功能预测等。第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法科学故事：NGF 的纯化NGF 是一种扩散性分泌多肽，其作用是促进神经元的存活（neural survival）和分化。Rita Levi-Montalcini 一直在 Victor Hamburger 实验室从事神经胚胎学（neuroembryology）的研究，主要研究移植或去除鸡趾对神经系
34、统发育的影响。他在研究中发现，移植的鸡趾不仅能发育，而且还能受到神经的支配（innervated）。神经解剖显示，受神经支配的鸡趾大小与在合适的位置支配鸡趾的神经元数目相吻合，即移植的鸡趾越大，支配它的神经元数目就越多。进一步研究表明，移植多余的鸡趾不仅能够增加支配它的神经元数目，而且还能增加位于其他位置不是支配它的神经元数目。于是，他认为可能有一种扩散性的分泌因子，能够在一定的距离范围内增加神经元数目。很快他设计了一个很巧妙的实验证明了这个设想：他将某些组织（甚至肿瘤组织）添加到鸡胚尿囊膜（chick embryo chorioallantoic membrane）的上方，结果能增加正在发育
35、中的胚胎内的神经元数目。鸡胚尿囊膜是将胚胎与鸡蛋气袋分开的一层膜，它能让气体和小分子物质通透，但细胞不行。这说明在组织液中一定存在某种可以通过鸡胚尿囊膜的因子，从添加的组织扩散到鸡胚内，控制神经元的命运。于是 Levi-Montalcini 决定开始纯化这种神秘的因子。然而，在当时，对于这种因子的化学本质还一无所知。而且也不知道这种因子真正的生理功能是不是就是提高神经元的数目。只是到了后来，才证实它就是一种神经生长因子，其功能是在胚胎发育的晚期控制神经细胞死亡的数目，而导致神经元数目增加和神经节（ganglia ）增大。就像纯化其他任何一种蛋白质一样，在纯化 NGF 之前，必须首先建立一种有效
36、的测定其活性的方法。但就当时的研究水平，研究人员只能在对鸡胚进行神经解剖以后，通过测量神经节的大小和存活在神经节的神经元数目来测活。而在正在发育的鸡胚中，进行这样的解剖显然既耗时又烦琐。如果以此作为测定 NGF 活性的基础，那么整个纯化工作的进展将会极其缓慢。Levi-Montalcini 在意识到使用上述鸡胚测活系统的困难以后，决定去巴西大学的 Carlos Chagus 实验室学习神经组织培养技术，以改进他的测活方法。因为当时的 Carlos Chagus实验室已成功地从幼小动物分离出背神经节（dorsal root ganglion，DRG），并能够让它们在培养液中存活。对已分离的 DR
37、G 的解剖要简单得多。作为一个访问学者，Levi-Montalcini 有一个惊人的发现：带有一种肿瘤组织（代号为 S-180）的 DRG 在培养中，DRG 的形态发生了很显著的变化。经过分析，发现原来从构成 DRG 的神经元上伸出了很多突触。这个发现是一个重要的突破，它不仅显示了某种扩散性分子的存在，而且提供了一种很方便的用于纯化这种分子的测活手段。使用 DRG 测活非常重要。首先，这种方法很方便，易于快速测定，但测定的生物活性跟最初的生活活性已有微妙的变化（测定突触的增加，而不是原来的神经元数目的增加）。这种测活手段后来成为寻找新的促进神经生长的因子的一种标准。也许，这样的因子可能（也可能
38、不）提高神经元的数目。事实最终证明，NGF 具有双重活性。因而活性测定方法的改变没有影响到对 NGF 本身的纯化。但如果参与神经伸展和促进神经元存活的不是同一种物质，那么 Levi-Montalcini 纯化到的将是另外一种因子。 Levi-Montalcini 是幸运的，因为 NGF 同时具有两种活性。有了这种测活方法，Levi-Montalcini 开始尝试从 S-180 组织中纯化 NGF。但不幸的是，S-180 中的 NGF 浓度很低，利用当时的纯化技术（20 世纪 50 年代早期），活性很容易损失，因此并没有取得成功。然而，就在差不多的时候，人们意识到，在蛋白质纯化中使用蛋白酶部分水
39、解组织，有助于蛋白质的溶解。在当时，蛇毒经常被作为蛋白酶很好的来源，于是他也用蛇毒对 S-180 的抽取物进行了处理。结果他意外地发现，蛇毒处理能够导致抽取物中 NGF 生物活性的显著提高。对照实验表明，升高的生物活性是从蛇毒中得到的，而不是来自 S-180。这个发现促使 Levi-Montalcini 考虑使用蛇毒来代替 S-180 组织作为分离NGF 的材料。蛇毒的确是 NGF 很好的来源，但获取大量的蛇毒并非易事。于是。Levi-Montalcini 想到从其他与分泌蛇毒的腺体有关的组织中寻找 NGF。很快发现，小鼠唾液腺是 NGF 的丰富来源，而且它比蛇毒更容易获取。于是，纯化 NGF
40、 的原材料又转到了唾液腺。一个有趣的问题是，存在于小鼠唾液腺中的 NGF 就是原来一直想从 S-180 组织中得到的 NGF 吗？在 20 世纪 80 年代，John Wagner 和 Pat DAmore 已经发现，一种被称为酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor,FGF）的蛋白质能够导致 PC12 细胞（一种神经元分化细胞株）的突触伸展。那么，是不是 S-180 产生的不是 NGF 而是酸性FGF 呢？于是，有人使用肝素亲和层析柱对 S-180 抽取物进行分离，结果得到大小相同的两个峰，第一个峰洗脱的位置与酸性 FGF 重叠，另一个刚好在 N
41、GF 的位置！面对这样的结果，我们真应该为 Levi-Montalcini 感到庆幸：如果他一直使用 S-180 作为分离 NGF 的来源，而且只收集第一个峰的话，那么最终被他纯化到的蛋白质一定是酸性的 FGF。另外一段趣事来自对一种被称为表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF ）的蛋白质的纯化。在 NGF 被纯化以后，需要制备它的抗体。于是，将 NGF 的制备物注射到兔子体内以产生抗血清，然而，在注射给刚出生的兔子的时候，发现被注射的“兔宝宝”很快睁开了眼睛。Cohen 决定使用这种分析方法来检测那种促进睁眼的物质的生物活性，这是鉴定和纯化 EGF 的第一个线索
42、。后来，EGF 得到纯化，并被证明是一种促进细胞分裂的蛋白质。如果阅读几篇关于 NGF 纯化的早期论文（Varon et al，Biochemistry，6:2202,1967 或Bocchini and Angeletti，PNAS 64:787,1969），你会发现那时的纯化需要很多步骤，似乎有点劳民伤财，但正是他们的早期工作使得 NGF 的结构最后得到确定。而随着人们对 NGF结构理解的深入，研究者才能够设计出更快速、更有效的纯化方案。Mobley 建立的两步快速纯化程序就是基于唾液腺最初分泌出来的 NGF 和几种其他蛋白质分子形成复合物的这种信息。该复合物被称为 7S NGF。如果将从
43、唾液腺制备的抽取物的杂质除去，然后直接通过羧甲基纤维素柱（carboxymethyl-cellulose column），几乎没有任何杂蛋白能被除去，于是就没有 NGF 的富集。但如果调低从这种柱的流出液的 pH，发现某些物质开始沉淀，7S NGF 发生解离，形成 -NGF。如果再将溶液调回到原来的第一次柱层析中使用 pH 和盐浓度以后，上第二根柱，那么 -NGF 就被吸附在柱子上，而大多数杂蛋白直接流出。再经过高 pH 和高盐溶液洗脱后， NGF 被洗脱下来，其纯度可达 99%。小结蛋白质的基本性质包括：紫外吸收、两性解离、胶体性质、沉淀反应、变性、水解和颜色反应等。蛋白质的紫外吸收是由三种
44、芳香族氨基酸造成的，最大吸收峰在 280 nm，它是测定溶液中蛋白质含量的快速简便方法。蛋白质也能发生两性解离，具有 pI，但不能直接计算，可使用等电聚焦的方法测定，p I 处蛋白质的溶解度最低。一个可溶性蛋白质分子在水中具有电泳、布朗运动、丁达尔现象和不能通过半透膜等典型的胶体性质。蛋白质分子表面的极性基团很容易吸附水分子，形成水化膜。水化膜的存在使得蛋白质颗粒彼此不能靠近，增加了蛋白质在溶液中的稳定性，防止它们从溶液中聚集或沉淀出来。凡是能破坏水化膜以及能中和表面电荷的物质均可使蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质的方法有：盐析、p I 沉淀、有机溶剂和重金属盐。蛋白质变性是指蛋白质受到某些理化因素的
45、作用，其高级结构被破坏、生物活性随之丧失的现象。导致蛋白质变性的有物理因素和化学因素。某些蛋白质的变性是可逆的，但大多数蛋白质的变性是不可逆的。蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。由于蛋白质折叠状态与去折叠状态的能量差异比较小，所以有时一个点突变就能显著改变一个蛋白质对热的稳定性。从一些生存在极端环境中得到的蛋白质往往能够抵抗极端因素的作用，这是因为它们的高级结构中含有更多的次级键。蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。根据被水解肽键的位置，蛋白酶可以分为内切蛋白酶和外切蛋白酶。外切蛋白酶又可以分为氨肽酶和羧肽酶。蛋白质的颜色反应是指蛋
46、白质分子中的肽键或者某些氨基酸的 R 基团可与某些试剂产生颜色反应，这些颜色反应经常被用来对蛋白质进行定性和（或）定量分析。多肽的人工合成一般使用固相合成方式，多肽人工合成中最重要的一步是对氨基酸的 -氨基提供保护，以保证反应定向和有序地进行。测定蛋白质一级结构的方法有间接测定法和直接测定法。N 端氨基酸测定的方法需要 Edman 试剂或 Sanger 试剂；C 端氨基酸的测定可用酶法或化学法。如果一种蛋白质分子含有二硫键，可使用对角线电泳对二硫键进行准确定位。在进行蛋白质纯化之前需要明确纯化蛋白质的目的、目标蛋白的测活方法和纯化蛋白质的原料。分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性质。根据溶解性、组成、形状、功能和三维结构，可对蛋白质进行不同形式的分类。
