1、盐胁迫处理对洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡情况、过氧化物酶分布的影响【实验目的】1、 巩固细胞中过氧化物酶反应的原理和方法；2、 巩固 DNA凝胶电泳反应的原理和方法；3、 巩固染色体染色反应的原理和方法；4、 了解洋葱鳞茎细胞在不同浓度不同离子作用下的状态。【实验原理】细胞凋亡又称程序性细胞死亡，普遍存在与生物界，是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的、由基因控制的、细胞遵循自身程序主动结束生命的过程。细胞凋亡主要特征包括：染色质凝集、断裂、趋边化，核裂解，质膜出芽、形成凋亡小体、但细胞膜完整，这些现象可通过形态学观察鉴定。过氧化物酶是一类重要的氧化还原酶，广泛存在于植物、动物和微
2、生物体内的各种组织细胞中。在动物的中性粒细胞及肝、肾细胞中，在植物老化的组织中尤其丰富。过氧化物酶在细胞内较多地存在于过氧化物酶体中，参与细胞中的各种氧化反应，将底物氧化。联苯胺与过氧化氢同时处理标本时，细胞内的过氧化物酶通过将底物过氧化氢分解，产生氧，进而能把无色的联苯胺氧化脱氢，生成蓝色的联苯胺蓝。联苯胺蓝很不稳定，可自然地转变为棕色的联苯胺棕。因此可以根据颜色反应来判定细胞内过氧化物酶的存在状况。中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.48.0 之间（由红变黄） 。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡
3、的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。改良苯酚品红可对染色体染色，是近年来观察植物染色体时新使用的比较理想的染色剂。【实验材料】1、 材料洋葱鳞茎内表皮2、试剂药品（1）联苯胺溶液：在 0.85%盐水内加入联苯胺至饱和为止，临用前加入 20%的过氧化氢，没 2mL加一滴。（2）0.1%钼酸铵溶液：称取 0.1g钼酸铵溶于 100mL 0.85%盐水。（3）中性红染液：将 0.
4、1g中性红溶入 100ml蒸馏水，用时稀释 10倍。（4）改良苯酚品红染液：改良苯酚品红染液：原液 A：取 3克碱性品红溶于 100毫升 70%酒精中，此液可以长期保存。原液 B：取 A液 10毫升加入 90毫升 5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2 周内使用)。原液 C：取 B液 55毫升加入 6毫升的冰醋酸和 6毫升 38%的甲醛(可长期保存)。染色液：取 C液 10-20毫升，加入 90-80毫升 45%醋酸和 1.5克山梨醇。放置 2周后使用，染色效果显著，可普遍用于植物组织的压片法和涂片法，使用 2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用。如果没有山梨醇，也能染色，但效果稍差。
5、（5）0.1mol/L NaCl，0.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L MgCl2 ，0.5 mol/L MgCl2 ，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L CaCl 2，清水（6）0.85%盐水溶液3、实验器材培养皿、量筒、手术刀、镊子、载玻片、盖玻片、纱布、滴管、烧杯、滤纸、标签纸、记号笔、显微镜【拟采用的方法、步骤】原材料制备1、活化洋葱鳞茎内表皮细胞。将洋葱至于清水中十二小时，让处于休眠状态的细胞活化。2、准备实验所需的所有试剂。包括：联苯胺溶液、0.1%钼酸铵溶液、改良苯酚品红染液、0.1mol/L NaCl，0.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L
6、 MgCl2 ，0.5 mol/L MgCl2 ，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L CaCl 2，清水。3、撕取洋葱鳞茎内表皮，分别置于 0.1mol/L NaCl，0.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L MgCl2 ，0.5 mol/L MgCl2 ，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L CaCl2，清水中，每种各设置两组平行实验，标记。4、每 2个小时取出个培养液中的洋葱鳞茎内表皮，按照以下步骤进行操作。分别记录2、4、6、8 小时后发生的现象，拍照，并填入以下表格。一、中性红检验细胞活性1、用吸管在载玻片的中央滴一滴清水；2、用镊子从洋葱的内表皮
7、上撕取一小块透明薄膜，用中性红染色 10-15min。3、把薄膜置于清水中漂洗 10-15min，用滤纸吸干表面水分；4、将表皮细胞置于载玻片上展开，滴一滴清水，盖上盖玻片，镜检。二、过氧化氢酶的显示（联苯胺反应）1、用镊子撕取处理过的洋葱内表皮细胞一小块透明薄膜；2、分别浸在溶有 0.1%钼酸铵（起催化作用）的盐水溶液的培养皿中 5min；3、分别浸在有联苯胺溶液的培养皿内 2min至切片出现蓝色；4、在 0.85%盐水溶液中洗 1min；5、将表皮细胞置于载玻片上展开，用滤纸吸干表面水分，滴一滴清水，盖上盖玻片，镜检。三、染色体染色（改良苯酚品红） 1、用镊子撕取处理过的洋葱内表皮细胞一小
8、块透明薄膜；2、用改良苯酚品红染液染色 20 min，冲洗表面浮色；3、将表皮细胞置于载玻片上展开，用滤纸吸干表面水分，滴一滴清水，盖上盖玻片，镜检。表 1 细胞形态记录表格细胞形态描述处理2h 4h 6h 8h编号 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3清水0.1mol/L NaCl0.5mol/L NaCl0.1 mol/L MgCl20.5 mol/L MgCl20.1 mol/LCaCl2，0.5 mol/LCaCl2，【可行性分析】本次实验经过查阅相关资料，确定了较为成熟的实验基本技术方法，具有较大的可行性。实验材料，基本上均能在市场上购买到，且实验室仪器设备齐全，能满足实验所需。
