1、疟原虫镜检技术 西双版纳州疾控中心 李鸿斌 分子生物学、血清学技术发展迅猛 ,但是确诊 疟疾的 “金标准 ” 仍然是血液显微镜检查显微镜检查是唯一可鉴别 4种疟原虫的方法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准实验室技术厚薄血膜的制作 镜检技术 血片制作制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄取血部位和血量取血方法 采血部位： 耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用 75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约 4微升血
2、量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转 24圈，涂成直径 0.81厘米大小圆形厚血膜。薄血膜 再取一小滴血 .将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方 .将采血玻片 (推片 )的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开 (如图示 ).正确的推片姿势标准的疟疾厚薄血膜片位置各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片厚薄血膜的标准 厚血膜血量适宜，不宜过多或过少薄 血膜平整 ,无皱折和空泡 .红细胞单层排列血片染色 两种染色方法 :吉氏染色法瑞氏染色法常用吉氏染色法吉氏染液 (原液 )的配置吉氏染粉 (Azure B type) 5g甘油 (纯 )
3、 250ml甲醇 (纯 ) 250ml 吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨 , 然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后 经过滤 即可使用。保存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于 5个小时稀释吉氏原液原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。吸取母液时，不要晃动瓶子 ,以免沉淀物泛起影响染色效果 .操作 1 （快染） 量筒内量 2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液 7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色
4、 10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作 2 (慢染 ) 在量筒内量 2ml蒸馏水或净水， 再滴加 吉氏原液 4滴，混匀， 滴入待染标本上，染色 3040min。清水细缓冲洗， 晾干镜检。吉氏染液浓度门诊染色将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 3%吉氏染液稀释液（ 3毫升吉氏原液加缓冲液或净水 97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色 30min（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 成批血片染色 质量好的染色 : 显微镜下核呈红色 ,胞浆呈蓝色 如果血片偏红 ,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝
5、,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏 酸偏 碱标 准染色过程血片平置于染色板上用吸管吸取已稀释的吉氏液约 2ml于厚薄血膜上，染色 10 min清水细缓轻轻冲去染液置玻片于插板上，自然晾干血片干燥后 , 用甲醇固定薄血膜血片制作注意事项 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 血片充分干燥后染色， 清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落 . 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法： 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) 半定量计数法 (厚血膜 ) 红细胞感染密度计算法 (薄血膜 ) 在厚血膜按视野
6、顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录 200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500 1 000 个。 白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数 计数的白细胞数 患者每微升血白细胞数 = 疟原虫数 /l血。 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以 8 000个白细胞计数 (国际标准 ) 。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫计数法举例假设计数 200 WBC中有 35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血 8000个白细胞计数 , 由此计算出每微升血液疟原虫密度为 ：35（疟原虫数） 200（计数的白细胞） x 8000（每微升血白细胞数） =1400
7、 / l答：该患者的疟原虫密度为 1400 / l。用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为 6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在 10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在 10个以上，但平均每个视野不到 1个虫，记录 “少 ”3.平均每个视野 15个虫，记录 “ ”4.平均每个视野 610个虫，记录 “+”5. 平均每个视野 11100个虫，记录 “+ ”6. 平均每个视野 100个虫以上，记录 “+ ”。半定量计数法薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别
8、，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为 Pv或 Pf。红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）显微镜下（ 10目镜 100 油镜 ）选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（ 约 300红细胞 /视野）红细胞疟原虫密度按以下公式计算：1.红细胞疟原虫感染率（ %）计算 红细胞原虫感染率（ %） = 疟原虫数 计数的红细胞数 X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算红细胞疟原虫密度 =红细胞原虫感染率 X红细胞数 /每微升血（ 男性 500万个
9、 /l；女性 450万个 /l）3. 如果能见到疟原虫，但是记数 10000个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为 红细胞感染率计算法（薄血膜）如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜未查见疟原虫 最少检查 100个厚血膜油镜视野未查见疟原虫人类四种疟原虫的基 本特征感染人的疟原虫有四种 : 恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale 恶性疟 P.falciparum 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状 ,不及时治疗可危及生命间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地区 ,主要是中部地区 病程良性 , 有复发 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热带非洲，特别是西非则很少见三日疟 P.malariae 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布 三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告 无复发卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫 ,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告 在我国已基本消灭 症状与间日疟相似 , 有复发四种疟原虫的形态特征
