1、江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）2Cement protein 的转化表达优化与纯化摘要:本实验将含有Cement protein基因片段的重组载体pCold TF转化入E.coli BL21(DE3)中, 在摇瓶培养的条件下，细胞中融合蛋白的含量达到 60%以上；然后利用包涵体处理、复性、Ni-IDA亲和层析的方法纯化蛋白。使用2.4L的菌液， 经诱导、 纯化、复性后大约可以得到10mg的蛋白；同时采用ELISA检测法，证实了纯化的SPG有很高的活性。关键词：融合蛋白的表达；Ni-IDA 亲和层析。Abstract:In this study, containing Cement pro
2、tein fragment pCold TF recombinant vector was transformed into E.coli BL21 (DE3), in shake flask culture conditions, cell protein content above 60%; Then inclusion treatment, renaturation, Ni-IDA affinity chromatography purified protein. Use 2.4L of bacteria, by induction, purification, can be refol
3、ded about 10mg of protein; the same time by ELISA assay, confirmed the purification of the SPG has high activity.Keywords: protein expression; Ni-IDA affinity chromatography.江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 1目 录1 引 言 12 材料及方法 12.1 材料和试剂 12.1.1 菌株与质粒 12.1.2 主要试剂 12.1.3 主要仪器 12.2方法与步骤 12.2.1 重组质粒的转化 12.2.2 转化子的筛选与鉴
4、定 12.2.3 Cement protein 的纯化 12.2.4 ELISA 检测活性： 13 结果与分析 23.1 Cement protein 的诱导表达： 23.2 Cement protein 的分离纯化： 33.3 ELISA 检测的结果： 33.4 成品包装 34 结论 3参考文献 3致谢 5江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）21 引言 1亲 和 层 析 的 原 理 是 ： 生 物 分 子 间 存 在 很 多 特 异 性 的 相 互 作 用 ， 它 们 之 间 都 能够 专 一 而 可 逆 的 结 合 ， 这 种 结 合 力 就 称 为 亲 和 力 。 亲 和 层 析 就 是
5、 通 过 将 具 有 亲 和 力的 两 个 分 子 中 一 个 个 固 定 在 不 溶 性 基 质 上 ， 利 用 分 子 间 亲 和 力 的 特 异 性 和 可 逆 性 ，对 另 一 个 分 子 进 行 分 离 纯 化 。 被 固 定 在 基 质 上 的 分 子 称 为 配 体 ， 配 体 和 基 质 是共 价 结 合 的 ， 构 成 亲 和 层 析 的 固 定 相 ， 称 为 亲 和 吸 附 剂 。 亲 和 层 析 时 首 先 选 择 与 待分 离 的 生 物 大 分 子 有 亲 和 力 的 物 质 作 为 配 体 ， 并 将 配 体 共 价 结 合 在 适 当 的 不 溶 性 基质 上
6、。 将 制 备 的 亲 和 层 析 剂 装 柱 平 衡 ， 当 样 品 溶 液 通 过 亲 和 层 析 柱 的 时 侯 。 待分 离 的 生 物 分 子 就 与 配 体 发 生 特 异 性 结 合 ， 从 而 留 在 固 定 相 上 ； 而 其 它 杂 质 不 能 与配 体 结 合 ， 仍 在 流 动 相 中 ， 并 随 洗 脱 液 流 出 ， 这 样 层 析 柱 中 就 只 有 待 分 离 的 生 物 分子 。 通 过 适 当 的 洗 脱 液 将 其 从 配 体 上 洗 脱 下 来 ， 就 得 到 了 纯 化 的 待 分 离 物 质 。亲 和 层 析 的 优 点 是 它 分 离 蛋 白 经
7、常 只 需 要 经 过 一 步 处 理 即 可 使 某 种 待 提 纯 的 蛋白 质 从 很 复 杂 生 物 蛋 白 质 混 合 物 中 分 离 出 来 ， 而 且 纯 度 很 高 。 此 外 蛋 白 在 纯 化 过 程中 得 到 浓 缩 ， 结 合 到 亲 和 配 基 后 ， 性 质 更 加 稳 定 ， 其 结 果 提 高 了 活 性 回 收 率 。 它 可以 减 少 纯 化 步 骤 ， 缩 短 纯 化 时 间 ， 对 不 稳 定 的 蛋 白 纯 化 十 分 有 利 。江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 12 材 料2.1 材料和试剂2.1.1菌株与质粒 大肠杆菌BL21(DE3), Ge
8、nscript保藏；表达载体pCold TF，Genscript保藏；pCold TF- Cement protein，Genscript构建 。2.1.2主要试剂 Ni-IDA亲和层析凝胶：Genscript生产；LB 液体培养基(g/L)：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 5g/L ,用 NaOH 调节该培养基的 pH 为 7.4；氨卡青霉素溶液：50g/mL；IPTG：0.5mmol/L；Tris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司,MP102； 2Lysis Buffer :
9、 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；pH8.0；Wash Buffer 1 : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；20 mM 咪唑 ；pH8.0；Wash Buffer 2 : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；50 mM 咪唑 ；pH8.0；Elution Buffer : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；250mM 咪唑 ；pH8.0；洗涤缓冲液 : 150mM PBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4；封闭液 : 脱脂奶粉(5%),PBS；蛋白电泳试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蛋白质分
10、子量标准为上海生工公司产品；丙烯酰胺储备液:30%（w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺 0.8 g，加蒸馏水至 100 mL，用滤纸过滤后于棕色瓶中 4存放；分离胶缓冲液（1.5 M/L，pH8.8）：18.15g Tris（分析纯） ，用 1M/L HCl 调节 pH 至8.8，加水至 100 mL，4存放；浓缩胶缓冲液（0.5 M/L，pH6.8）：6g Tris，用 1M/L HCl 调节 pH 至 6.8，加水至100mL，4存放；Tris-甘氨酸电泳缓冲液：6g Tris，28.8g 甘氨酸，2g SDS，加水至 2L；SDS
11、溶液(10%)：10g SDS，加水定容至 100mL，完全溶解后室温存放；过硫酸铵溶液(10%)：0.1 g 过硫酸铵（分析纯） ，加 1 mL 蒸馏水溶解；5样品缓冲液：0.6mL Tris-HCl 缓冲液（1mol/L，pH 6.8） 、5 mL 50%（v/v）甘油、2 mL 10% SDS、0.5 mL巯基乙醇、1 mL 1%（w/v）溴酚蓝、0.9 mL 蒸馏水。4存放；12%分离胶的配制：蒸馏水 3.5 mL，30%丙烯酰胺储备液 (A 液)4 mL，分离胶缓冲液 (B 液)2.5 mL，10%过硫江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）2酸铵 50l，TEMED 5 l；5%浓缩胶
12、的配制：蒸馏水 2.3 mL，30%丙烯酰胺储备液 (A 液)0.67 mL，浓缩胶缓冲液(C 液)1.0 mL，10%过硫酸铵 30l，TEMED 5l；考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝 R-250 1 g，甲醇 450 mL，冰醋酸 100 mL，蒸馏水 450 mL；脱色液：甲醇200 mL，冰醋酸200 mL，蒸馏水1600 mL。封闭液：5%脱脂牛奶或者20%BSA2.1.3主要仪器PK-8D 型电热恒温水槽 (上海精宏实验设备有限公司)TH2-25 大容量恒温震荡器 (上海欣蕊自动化设备有限公司)JY98-3D 超声细胞破碎仪 (宁波新芝生物科技有限公司)GL21K 高速离心机 (湖南
13、湘仪仪器有限公司)HL-2 恒流泵 (上海沪西分析仪器厂)IHZD-3 紫外检测仪 (上海沪西分析仪器厂)TH-300 梯度混合器 (上海沪西分析仪器厂)5414D 型台式高速离心机 (美国 Eppendrof 公司产品)垂直板状电泳系统(Bio-Rad 公司产品)移液枪（DAIGGER）水浴锅 DK-8D（上海一恒仪器）江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 13 方 法 与 步 骤3.1 Cement protein重组质粒的转化 31）取重组质粒；pCold TF- Cement protein 4l于100l感受态细胞BL21中，冰浴30min；2）42水浴热激90s；3）立即放置冰上冰
14、浴3 min；4）加入600 l 37预热的LB液体培养基，摇床震荡培养30min；5）12000rpm 离心2min，弃400l培养基，剩约200l，混匀菌体，涂布平板(A +),37过夜培养；3.2 Cement protein优化与表达鉴定 41）取5支4mlLB试管培养基分别标记对照、1、2、3。2）其中对照中加入50ul葡萄糖，对照、1、2、3，分别加入4ul A+，从平板中挑取5个白色菌落。分别加入5支试管。3）对照、1、2、37摇床培养,待OD=0.6时，加4ul IPTG，37，诱导培养4h；4）4号试管37摇床培养,待OD=0.6时，加2ul IPTG，15，过夜诱导12h；
15、5）取4只EP管分别标记对照、1、2、3。6）从试管中取200ul菌体，依次加入EP管中。7）11000rpm,4min,4离心4min,去上清。8）沉淀用15l Tris重悬；再加入15l 2Loading Buffer，沸水煮15min，离心，SDS-PAGED 5 电泳检测。3.3 Cement protein可溶性分析1）取4支1.5mlEP管标记1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表达鉴定的1号管和3号管菌液分别加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm，3min，离心去上清，沉淀用200ulTris重悬。2）超声破碎冰水浴 6 （间歇时间：3s; 工作时间：3s；全程时间：10m
16、in；） 。3）5000rpm，3min，离心，上清液分别倒入1-上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重悬，4支EP管各加入200ul2Loading Buffer混匀沸水浴15分钟。4）4支EP管各取8ul进行SDS-PAGE检测。3.4 Cement protein扩大培养1）接种，1%的接种量，接种到4mL液体LB培养基中，30,200rpm,摇床培养过夜，即种子液；2）转接， 4mL的种子液转接到1LLB摇瓶,并向其中加入800l 的A +，37，180rpm 摇床震荡培养4 h； 3）诱导，1L培养基加入400l的IPTG，于15 摇床内，180rpm，过夜
17、诱导12h；江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）24）收菌，7000rpm,7min,4离心收集菌体，收集的菌体放于-20备用。3.5 蛋白RAC-22的纯化 73.5.1. 超声破碎：1）1L培养液菌体 用 30mL Lysis Buffer重悬，将菌液置于冰水中，超声破碎（间歇时间：3s; 工作时间：3s；全程时间：15min；） ；3.5.2菌体分离： 81）破碎液11000RPM离心15分钟。取上清。C. Ni柱纯化蛋白1）装柱：将层析柱洗净，用去离子水润洗柱子及管道，用适量的Ni-IDA介质（5ml）装入层析柱中；2）平衡：静置完成后，用Lysis Buffer平衡介质至紫外检测仪示
18、数稳定；3）上样：上清液以1ml/min的速度上样；4）洗杂：上样完成后，先用Lysis Buffer洗涤；而后用Wash Buffer 1洗涤杂蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定。并收集样品。标记“20” 。再用Wash Buffer 2洗涤至紫外检测仪数值趋于稳定。并收集样品，标记“50” 。5）洗脱：用Elution Buffer洗脱目标蛋白，当紫外检测仪的示数开始变化后，取20ul加入350ul的G250中观察颜色变化。当有G250由棕色变为蓝色时，开始收集流出液于无菌的塑料瓶中,洗脱直至样品不再使G250变蓝并紫外检测仪示数不再下降。3.5.3透析 9 ：1）取2000ml透析液，将洗脱所
19、得的溶液装入透析袋中，4，过夜透析12h， 3.5.4. 蛋白复性:将蛋白稀释至10mg/ml,100ul/ml的速度加入20倍体积的0.1M磷酸盐缓冲液.菌液于 7000RPM,离心20分钟.取上清。 3.5.5. 蛋白浓度和纯度的检测1）蛋白浓度测定，取3mlG250,加入比色皿中。A调100%，T调零。取透析所得的蛋白溶液， 50ul加入3MLG250中混匀，待分光光度计数值不再变化，记录数值。2）电泳检测蛋白纯度，将蛋白电泳图片经专业软件测定蛋白纯度。取样，取10l 电泳。3.6蛋白印记检测（Western blot） 103.6.1电泳1）取样，取10l，SDS-PAGE电泳。3.6
20、.2转膜1）准备4-6张滤纸和1张PVDF膜或NC膜。戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。转膜前，NC膜要置于去离子水中浸泡1 min；PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡20 min。2）在转移液里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒或滴管、滤纸和浸过的膜。江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 13）取出SDS-PAGE胶将浓缩胶轻轻刮去。将胶在转膜缓冲液中浸泡5分钟左右，以平衡离子强度。4）打开平放底部黑色电极（阴极） ，放一张海绵垫片，擀气泡。于海绵垫片上放置2-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，擀气泡。取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上，排除所有气泡。将PVDF膜或NC膜置于
21、聚丙烯酰胺凝胶上，排除所有气泡。在膜上盖上2-3张转移缓冲液浸泡过的滤纸，排除所有气泡。最后盖上另一个海绵垫，放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板（白色） ，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。5）将夹子放入转移槽中。转膜在冰上进行，用磁力搅拌器搅拌。用恒压60V或恒流200mA转移2 h-2 h 30 min。3.6.3转膜免疫反应1 ）取膜，将膜正面超上在PBST溶液中摇动五分钟，移至含有封闭液的平皿中，室温脱色摇床上4度静置过夜。 2）取出膜在PBST溶液中洗5分钟，放入含有一抗的PBST缓冲液中，室温下孵育1.5 h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min；3）膜放入含有二抗的P
22、BST溶液中，室温下孵育1.5 h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min；再用PBS洗二次，每次5min，进行化学发光反应。 3.6.4化学发光，显影，定影 1 ）将A和B两种试剂(Genscript公司HRP标记的底物)在离心管中上等体积混合，避光保存；用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，正面朝上置与平整的保鲜膜上，加上以上的A、B混合液2ml，使膜正面与液体充分接触，避光静置3分钟；3min后，用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，置与另一平整的保鲜膜上，包好，放入X-光片夹中。 2 ）在暗室中，将1显影液和定影液各500ml分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片
23、，用切纸刀剪裁适当大小；把X光片放在膜上，关上X-光片夹，曝光3分钟，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。立刻将X-光片浸入定影液中，定影10min，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）24结 果 与 分 析4.1Cement protein的表达鉴定 11挑取菌落至4 mL培养基培养，标记对照、1、2、3，摇床培养当OD 6000.6 时加入4ulIPTG，而后对照、1、2、37诱导4小时，3号试管15过夜诱导12h，离心收集菌体,取样进行SDS-PAGE电泳分析。Cement protein表达鉴定检测
24、图1.1如图所示，根据专业软件对蛋白基因序列分析此融合蛋白大小为58kd。对照组没有58kd处无目的蛋白的表达，1号、2号为37、4h诱导有58kd处明显表达条带。3号为15、过夜诱导58kd处也有明显表达条带。对照 1 2 3 M图1.1 Cement protein 64P-BA1蛋白表达鉴定Lane1：对照 lane2：1 号Lane3：2 号 lane4：3 号Lane5： M100kd75kd50kd32kd25kd15kd江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 14.2Cement protein的可溶性分析取上述1号管3号管菌液400ul分别加入2支EP管中，离心去上清，沉淀用20
25、0ulTris重悬。冰水浴超声破碎。离心，上清液取样电泳，沉淀用200ulTris重悬，电泳。Cement protein可溶性分析检测图3.2如图所示，破碎离心上清和沉淀中58kd处都有明显表达条带，因为蛋白在上清中活性较高，这意味着蛋白正确折叠率高，易与和柱体结合，纯化所得蛋白活性较高。而15、过夜诱导蛋白分泌速率相对较慢，蛋白易正确折叠，所以优先采用15、过夜诱导。这就是所谓的优先做上清。图1.2 Cement protein 64P-BA1蛋白可溶性分析Lane1：对照 lane2：1 号Lane3：2 号 lane4：3 号Lane5： M1-上清 1-沉淀 3-上清 3-沉淀 M1
26、00kd75kd50kd32kd25kd15kd江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）24.3Cement protein的分离纯化本实验采用Ni-IDA亲和层析一步纯化蛋白 Cement protein，最终得到的融合蛋白纯度能达到90%以上，Cement protein的分离纯化检测图如图所示Lane1为全菌破碎后蛋白条带58KD处有明显表达条带；Lane2为上清中蛋白条带58KD处有明显表达条带；lane3为上清过柱后流出条带；融合蛋白表达条带降低很多，说明融合蛋白大量挂柱；Lane4为20mm咪唑洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗出；Lane5为50mm咪唑洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗
27、出；Lane6为250mm咪唑洗脱后流出融合蛋白被大量洗脱，且浓度和纯度很高。2 3 Marker 图1.3 Cement protein 64P-BA1蛋白纯化检测图Lane1：全菌 lane2：上清Lane3：流出 lane4：20Lane5： 50 Lane5：250 100kd75kd50kd32kd25kd15kd江苏农林职业技术学院毕业论文（设计） 14.4Cement protein的 Western blot检测Cement protein 的Western blot检测图如图Western blot检测58kd处有融合蛋白条带，证明纯化得到蛋白为实验预期纯化的融合蛋白。图1.
28、4 Cement protein 的Western blot检测图Lane1：全菌 lane2：融合蛋白江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）25 结 论5.1 本实验利用 Ni 离子与咪唑基特异的亲和性,使螯和有 Ni 离子的亲和层析柱可以用来纯化含有组氨酸的融合蛋白,在 Cement protein 经过重组后,融合蛋白带上了 HIS标签,在纯化时可以特异性结合在层析柱上,用含高咪唑的 Elution Buffer 溶液使蛋白Cement protein 与杂蛋白分开由电泳的检测结果可知，用这种简单、快捷的一步纯化的方法,能够得到达到电泳纯的蛋白，而 HIS 标签并不影响蛋白 Cement
29、protein 的活性；5.2 重组后的蛋白Cement protein虽然很稳定，但在纯化的过程当中还要使蛋白溶液始终保持在低温冰浴的环境中。接触到蛋白的容器一定要灭菌干净，避免杂菌的污染；5.3 在用 IPTG 进行诱导表达时先做一个浓度梯度，实验发现终浓度在 1mM,温度为 37,时间为 4h,融合蛋白产生量最多，但易形成包涵体。终浓度为 0.5mM,温度为 15,时间为 12h，上清中融合蛋白增多。参考文献l 4 赵永芳编著。生物化学技术原理及其应用（第二版）。武汉大学出版社.2 Sven Lofdal,Bengt Guss,Mathias Uhlen,Lennart Philipso
30、n,and Martin Lindberg.gene for Streptococcal Protein G.Proc,Natl,Acad,Sci,USA,Vol.80.pp697-701,February 19833 范代娣，沈立新，米珏编著。重组蛋白分离与分析。化学工业出版社， 2 P104（德）amp,(德)B.Wittmann-Liebold,(希腊)T.Choli-Papadopoulou。蛋白质结构分析：制备，鉴定与微量测序 。北京科学出版社5 phyllis，nano db，蛋白质电泳实验技术6 叶勤主编。现代生物技术原理及其应用。中国轻工业出版社7 Salamon ML，Ahh
31、ausen PL，Gupta McThe effects of BMP 一 7 in a rat posterolateral inter transverse process fusion modelJJ Spinal Disord Tech，2003，l6(1)：908 Simon M， Feliers D，Arar M，et o1Cloning of the 5 -flanking region of the murine bone morphogenetic protein一7 geneJMol Cell Biochem，2002，233(1-2)：3l9 Chang CF，Lin S
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