1、溶血性贫血 G6PD试验、血红蛋白电泳、 Coombs试验、红细胞渗透脆性试验 .,什么叫溶血性贫血？各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。,病 因 （一）红细胞内存在缺陷 1.遗传性： （1）膜的缺陷：遗传性球形细胞增多症 （2）酶的缺乏：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏 （3）珠蛋白生成障碍：即血红蛋白病肽链合成量的异常：地中海贫血肽链质的异常：异常血红蛋白病 2.获得性：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）,（二）红细胞外在因素 1.免疫性因素： （1）自身免疫性溶血性贫血（AIHA） （2）同种免疫性溶血性贫血：新生儿溶血症；血型
2、不合的输血反应 2.物理和机械损伤： （1）行军性血红蛋白尿症、人工心脏瓣膜 （2）物理损伤：大面积烧伤、放射损害 3.化学药物和生物因素： （1）磺胺类、苯类、砷和铅等 （2）疟疾、溶血性链球菌、支原体肺炎、蛇毒和毒蕈中毒,临床表现 （1）急性溶血性贫血：头痛、呕吐、高热腰背四肢酸痛，腹痛酱油色小便面色苍白与黄疸严重者有周围循环衰竭、少尿、无尿 （2）慢性：贫血； 黄疸； 肝脾肿大,如何诊断溶血性贫血？第一步 确定是否有溶血 第二步 哪一类溶贫一、首先确定有溶血,1、找出RBC破坏增多的依据 （1）RBC寿命测定15天（正常半衰期2532天） （2）血片见RBC碎片 （3）血浆游离HB增高（
3、血管内溶血） （4）HB尿检测（），酱油色 （5）尿含铁血黄素试验（） （6）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高 （7）尿胆原增高,（8）血清结合珠蛋白检测 均减低2、 找出RBC代偿增生的依据 （1） 网织RBC增多,网织RBC,有核红细胞,（2） 外周血见有核RBC （3） 骨髓红系统增生明显活跃 （4）红细胞形态异常：多染性、Howell-Jolly小体、cabot环、红细胞碎片,Howell-Jolly小体,cabot环,红细胞碎片,镰状红细胞,球形红细胞,脾脏，窦状隙被球形 红细胞塞满了,靶性红细胞,二、哪一类溶血性贫血？,常用筛查病因诊断试验 （1）红细胞渗透脆性：增加：球形细胞减
4、低：地中海贫血 （2）Ham试验阳性（PNH） （3）高铁血红蛋白还原试验和G-6-PD酶活性试验：G6PD缺乏症 （4）血红蛋白电泳和碱变性试验：地中海贫血 （5）异丙醇试验：不稳定血红蛋白病 （6）Coombs试验（AIHA）,一、红细胞膜缺陷的检验,一、红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,酸溶血试验 (Ham),1、 红细胞渗透脆性试验原理:是测定红细胞对不同浓度 低滲氯化钠溶血的抵抗能 力 渗透脆性减低 渗透脆性增高,方法：,0.6,0.4,0.2,NaCl,参考值 开始溶血：0.42%0.46%（4.24.6g/L）NaCL完全溶血：0.28%0.34%（2.83.4g/L）Na
5、CL,临床意义 （1）脆性增高 遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低 小细胞低色素性贫血：海洋性贫 血、缺铁性贫血,红细胞孵育渗透脆性试验 原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高 。 参考值 未孵育 50%溶血44.45%孵育 50%溶血4.655.9% 意义 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症脆性减低 缺铁性贫血 珠蛋白生成障碍性贫血,一、红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,酸溶血试验 (Ham),2、酸溶血试验 (Ham) 原理：红细胞+弱酸血清（pH6.66.8） 37 1小时 红细胞膜对补体敏感， 备解素作用下溶血。,临床意义：正常
6、人阴性，阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH）,PNH不同时间尿样,含铁血黄素,Ham试验,二、红细胞内酶缺陷的检验,二、红细胞内酶缺陷的检验,自身溶血试验及纠正试验,高铁血红蛋白还原试验,1、自身溶血试验及纠正试验原理：细胞内酶缺陷（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6PD）(丙酮酸激酶)，葡萄糖效解障碍，不能提供足量ATP，红细胞在自身血浆中温育48小时，不能继续从血浆摄取葡萄糖作能量来源，ATP减少，不能维持红细胞内钠泵作用，导致溶血增加。在温育过程中分别加入葡萄糖和ATP作纠正物，看溶血能否纠正。,参考值： 正常人轻微溶血，溶血度3.5%； 加葡萄糖、ATP溶血明显纠正， 溶血度1%。 临床意
7、义： （ 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6PD缺乏症 蚕豆病）溶血增加，加葡萄糖、ATP溶血部分纠正，（丙酮酸激酶缺乏症）加葡萄糖不能纠正。加入ATP能纠正。,二、红细胞内酶缺陷的检验,自身溶血试验及纠正试验,高铁血红蛋白还原试验,2、高铁血红蛋白还原试验原理：正常血红蛋白是亚铁血红蛋白，可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶可作为血液中高铁血红蛋白还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为
8、褐色，在630650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。,参考值：定性：阴性。 定量：还原率75%。 临床意义： （1）阳性：葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症、纯合子型、中间反应为杂合子型。 （2）定量30%：G-6-PD缺乏症纯合子型。 （3）定量74%31%：G-6-PD缺乏症杂合子型,注意事项：,（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。 （2）抗凝剂以38g/L柠檬酸钠或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标本可保存1周左右。肝素抗凝也可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本只能保
9、存3天。草酸盐抗凝不适于本法。 （3）ACD抗凝剂量不宜太多，血液与ACD抗凝剂按10.15混合即可，否则可因pH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。,二、红细胞内酶缺陷的检验,G-6-PD荧光斑点法试验,G-6-PD活性测定,1、G-6-PD荧光斑点试验原理：在葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和NADP存在下葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光参考值：正常人会出现强荧光。G6PD缺乏者的荧光很弱；杂合子或某些G6PD变异体则可能有轻度到中度荧光注意事项：1、此法是直接测定NADPH的量，特异性较好2、每次检测均要做阴阳
10、性对照,二、红细胞内酶缺陷的检验,G-6-PD荧光斑点法试验,G-6-PD活性测定,2.1、G-6-PD活性校正值测定原理：G-6-P+NADP+ G6PG 6-PGA+NADPH+H+6-PGA+NADP+ 6-PGD R-5-P + NADPH +H+CO2，在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。参考值：,临床意义： 1、G-6-PD、G-6-PD/6-P-GD均偏低 见于G-6-PD缺乏症2、G-6-PD偏低、而6-P-GD升高 见于G-6-PD重度缺乏 合并地中海贫血症3、 G-6-PD与6-P-GD均升高 多见于单纯性地中海贫血4、 G-6-PD正常， 6-P-GD
11、均升高 多见于G-6-PD杂合子合并地贫或其他增生性贫血患者,2.2、G6PD活性简易法测定原理：G-6-P+NADP+ G6PG 6-PGA+NADPH+H+在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。参考值：健康成年人，红细胞G6PD活性为8-18U/g Hb,临床意义： 红细胞G-6-PD催化反应生成的NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，还原性谷胱甘肽（GSH）是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件。红细胞G6PD缺乏者，在服用某些药物（如抗疟药、砜类药、伯氨喹啉、磺胺药等）及食用蚕豆后，代谢产生自由基，或者氧合血红蛋白作用形成的H2O2，使GSH氧化成GSSG，由于G
12、SH降低，Hb的疏基失去GSH保护，被氧化变性形成Heinz小体。红细胞膜失去疏基保护而功能受损，导致溶血，G6PD基因在X染色体上，通过女性遗传，男性患者居多。G-6-PD缺乏或者减少见于G6PD缺乏症、药物反应、蚕豆病、感染等。,治疗措施： 对急性溶血者，应祛除诱因。在溶血期应供给足够水分，注意纠正电解质失衡，口服碳酸氢钠，使尿液保持碱性，以防止血红蛋白在肾小管内沉积。贫血较轻者不需要输血，祛除诱因后溶血大多于1周内自行停止。贫血较重时，可输给G-6-PD正常的红细胞1-2次。应密切注意肾功能，如出现肾功能衰竭，应及时采取有效措施。新生儿黄疸可用蓝光治疗，个别严重者应考虑换血疗法，以防止胆
13、红素脑病的发生。抗氧化剂还原型谷胱甘肽可稳定红细胞膜，从而减轻溶血疾病预防：在G-6-PD缺陷高发地区，应进行群体G-6-PD缺乏症的普查;已知为G-6-PD缺乏者应避免进食蚕豆及其制品，忌服有氧化作用的药物，并加强对各种感染的预防。,注意事项： 1、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症是世界上最多见的红细胞酶病，据统计全球约有近4亿人G-6-PD缺陷。本病常在疟疾高发区、地中海贫血和异常血蛋白病等流行地区出现，地中海沿岸、东南亚、印度、非洲和美洲黑人的发病率较高。我国分布规律呈“南高北低”的态势，长江流域以南，尤以广东、海南、广西、云南、贵州、四川等地为高发区，发生率为4%-1
14、5%，个别地区高达40% 2、全血标本中G-6-PD比较稳定，但溶血后极不稳定。若不能及时测定，将全血标本保存于4 ，可稳定数天。 3、年轻患者如红细胞计数正常，单纯G-6PD活性升高，一般无临床意义。,三、血红蛋白异常的检查,血红蛋白的组成 血红蛋白由血红素与珠蛋白组成 血红素：铁原子与原卟啉复合物。 珠蛋白：包括、和珠蛋白6种。血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（Hb）组成不同。,Hb的种类 A.正常的Hb分三类a.HbA(22)b.HbF(22) c.HA2(22) B.异常Hb有两类a.快速异常Hb:稳定Hbb.慢速异
15、常Hb:不稳定Hb,三、血红蛋白异常的检查,血红蛋白电泳试验,异丙醇试验,1、血红蛋白电泳试验原理：各种Hb的主要差异是组成珠蛋白的肽链不同，不同的肽链含有不同的氨基酸，因此具有不同的等电点，在PH的缓冲液中带有不同的电荷。在碱性缓冲液中，Hb带负电荷，反之带正电荷。肽链中一个或几个氨基酸被取代或缺失后，通常所带的电荷也随之发生改变。在电场中，带有不同电荷的珠蛋白分子分别向正极或负极移动，其迁移速度和带电荷的强弱相关。,常见血红蛋白电泳方法1、醋酸纤维膜电泳2、琼脂糖凝胶电泳3、全自动Hb电泳仪,醋酸纤维膜电泳主要过程琼脂凝胶电泳RBC洗涤制备溶血点样电泳染色与脱色扫描法比色法:分区剪下色带，
16、洗脱分区切割色带,融化琼脂，干燥,透明比色,血红蛋白电泳设备,常见血红蛋白电泳方法1、醋酸纤维膜电泳2、琼脂糖凝胶电泳3、全自动Hb电泳仪,全自动Hb电泳仪 目前国内使用的主要有 美国的Helena电泳仪、扫描仪和分析系统。 法国的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。 国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。1.通过扫描定量给出HbA、HbA2和HbF值。 2.异常区带通过查表确定。,毛细管电泳分离的血红蛋白定性区域 Z 15 : Hb H Z 14 : / Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore Z 12 : Hb Barts, Hb J-Providence,
17、Hb J-Mexico, Hb J-baltimore. Z 11 : Denaturated Hb A, Hb Kaoshiung Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom Penh Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Alegre Z 6 : Hb D-Punjab, denaturated Hb E, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln. Z
18、5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Kln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant,Hb病为世界上发病率最高危害最大的单基因
19、遗传病，被WHO列为严重危害人类健康六大疾病之一。全球约有4.83%的人口携带Hb病基因,每年各类重型地贫(包括地贫复合异常Hb病类型)患儿的出生率不低于2.4。据此推算,全球每年至少约35万Hb病患儿出生;至今为止，全球在分子水平上已鉴定出近1000种不同的珠蛋白突变基因，其中包括700多种异常Hb变异体和200余种地贫基因以及70多种地贫突变,其中中国人群中异常Hb、地贫基因和地贫突变各占70多种、34种和11种。,血红蛋白（Hb）病 1.血红蛋白病：基因突变导致合成的珠蛋白肽链结构异常（如：镰状细胞血红蛋白病/HbS） 2.地中海贫血：基因突变导致一种或多种珠蛋白肽链合成减少或缺失如（/
20、地贫） 3.获得性血红蛋白病：接触或误服化学药物,临床常见的异常血红蛋白 以速度快慢排序1.血红蛋白E/A22.血红蛋白D/S 3.血红蛋白G 4.血红蛋白K 5.血红蛋白J 6.血红蛋白H,注意事项： 1、HbA2定量在10%以上,应考虑为HbE 2、HbE纯合子只有HbF和HbE,HbE高达95%以上 3、HbBarts 区带在HbH区带后,泳动速度比HbH稍慢些,有Barts 区带,一般都有H区带,H含量高达30%多,但不会超出40%,低少到1%左右,异常血红蛋白鉴别试验 1、血红蛋白PH6.5电泳试验：鉴别HbH与其他Hb2、碱变性试验:鉴别HbF3、异丙醇试验：存在不稳定血红蛋白如U
21、Hb或HbH4、红细胞镰变试验：鉴别HbS（镰形红细胞）5、血红蛋白C实验：鉴别HbC(血涂片见六角形或棒状结晶体（靶形红细胞）,四、免疫性溶血的检验 1、抗人球蛋白试验 ( Coombs) 原理： 直接抗人球蛋白试验： 自身免疫性溶血性贫血（AIHA）血清中有抗自身红细胞的不完全抗体，他与表面附有相应抗原的红细胞结合，成为致敏红细胞，加入抗人球蛋白与红细胞表面不完全抗体结合，使红细胞相互连接起来出现凝集现象。来证实红细胞表面有不完全抗体。抗人球蛋白直接试验阳性；间接抗人球蛋白试验 ：用已知抗原的红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体；敏感性较差。,抗人球蛋白,IgG不完全抗体,RBC,直接抗球
22、蛋白试验（DAT） 阳性（右）,结果解析： 直接试验是检查被检红细胞上有无不完全抗体，间接试验是检查血清中游离的不完全抗体。直接Coombs试验较间接试验对AIHA更有诊断价值。用特异性单价抗血清可将AIHA分为三型：IgGC3阳性，占67；单独IgG性，占20；单独C3性，占13；,临床意义 1、正常人抗人球蛋白试验直接、间接均阴性。 本试验阳性结果主要见于下列几种情况： 2.自身免疫性贫血，（IgG）型引起的溶血性贫血，本试验直接反应常呈强阳性，间接反应大多阴性，但亦可阳性。,临床意义 3.药物诱发的免疫性溶血性贫血-甲基多巴型：直接及间接反应均阳性。青霉素型：直接反应阳性，间接反应阴性，
23、以上二型如以正常红细胞先与有关药物于37培育后再加病人血清、间接反应均为阳性。福阿亭型：（奎宁等药物）抗体通常为IgM，偶有IgG型者，直接反应为阳性，间接反应阴性，但如用IgG抗血清做试剂则结果大部分均为阴性，但如培育时加入新鲜正常人血清（供应补体）则结果为阳性。,临床意义 4.冷凝集素综合征直接反应阳性，间接反应阴性（试验需在37下进行）由于本病红细胞膜附着的是补体C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做试验时，则结果阴性，如以抗补体的抗血清做试验则直接反应阳性。 5.新生儿同种免疫溶血病，因Rh血型不合所致溶血病，直接及间接反应均强阳性，持续数周、换血输血后数天内
24、可变为阴性，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，结果常为阴性或弱阳性。,临床意义 6.红细胞血型不合引起的输血反应，ABO或Rh血型不合输血，供者的红细胞被受者的血型抗体致敏，在供者被致敏的红细胞完全破坏以前，直接反应阳性，Rh阴性者如过去不曾接受过Rh阳性者的血或曾妊娠胎儿为Rh阳性者，间接反应阳性，如无上述接触，第一次输血后（Rh阳性的血），数天之内间接反应也会变为阳性,临床意义 7.其它在传染性单核细胞增多症、SLE、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、癌肿、铅中毒、结节性动脉周围炎、EVan氏综合征等，病人直接反应亦可阳性，阵发性寒冷性血红蛋白尿症患者中，急性发作后用抗补体血清做试验直接反
25、应常为阳性。 。,HA的治疗 溶血性贫血是一组异质性疾病，其治疗应因病而异。正确的诊断是有效治疗的前提。下列是对某些溶血性贫血的治疗原则。 1.去除病因 获得性溶血性贫血如有病因可寻，去除病因后可望治愈。药物诱发性溶血性贫血停用药物后，病情可能很快恢复。感染所致溶血性贫血在控制感染后，溶血即可终止。 2.糖皮质激素和其他免疫抑制剂 主要用于某些免疫性溶血性贫血。糖皮质激素对温抗体型自身免疫性溶血性贫血有较好的疗效。环孢素和环磷酰胺对某些糖皮质激素治疗无效的温抗体型自身免疫性溶血性贫血或冷抗体型自身免疫性溶血性贫血可能有效。 3.输血或成分输血 因输血在某些溶血性贫血可造成严重的反应，故其指征应
26、从严掌握。阵发性睡眠性血红蛋白尿症输血后可能引起急性溶血发作。自身免疫性溶血性贫血有高浓度自身抗体者可造成配型困难。此外，输血后且可能加重溶血。因此，溶血性贫血的输血应视为支持或挽救生命的措施。必要时采用红细胞悬液或洗涤红细胞。,HA的治疗 4.脾切除 适用于红细胞破坏主要发生在脾脏的溶血性贫血，如遗传性球形红细胞增多症、对糖皮质激素反应不良的自身免疫性溶血性贫血及某些血红蛋白病，切脾后虽不能治愈疾病，但可不同程度的缓解病情。 5.其他治疗 严重的急性血管内溶血可造成急性肾衰竭、休克及电解质紊乱等致命并发症，应予积极处理。某些慢性溶血性贫血叶酸消耗增加，宜适当补充叶酸。慢性血管内溶血增加铁丢失，证实缺铁后可用铁剂治疗。长期依赖输血的重型珠蛋白生成障碍性贫血患者可造成血色病，可采用铁螯合剂驱铁治疗,谢谢,
