1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T 23252014 猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法 Method of RT-PCR for the detection of transmissible gastroenteritis virus 2014 -07 -05发布 2014 -09 -05实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 23252014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研
2、究院。 本标准主要起草人：于学武、谷志大、赵晓彤、陈瑶、赵凤菊、赵培、闫明媚、兰德松、关乃鹏、关淼、孙世宇、华泽军、刁贺军、王志国 DB21/T 23252014 1 猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中 TGEV核酸的检测。 本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日
3、期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） bp：碱基对（base pair） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription pol
4、ymerase chain reaction） Taq酶：HS Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus） PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution） TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer） 4 原理 TGEV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，
5、在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 5 仪器和器材 DB21/T 23252014 2 本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上）、冰箱（28，-20和-70三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、微量移液器和吸头。 6 试剂和材料 6.1 Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于48 保存。 6.2 氯仿：4 预冷。 6.3 异丙醇：4 预冷。 6.4 75%乙醇：用新开启
6、的无水乙醇和DEPC水配制，-20 预冷。 6.5 DEPC水：去离子水中加入0.1% DEPC，37作用1 h，121（2），高压灭菌15 min。 6.6 RNA酶抑制剂（40 U/L）。 6.7 DNA聚合酶：HS Taq DNA聚合酶（5 U/L）。 6.8 dNTP（10 mmol/L）。 6.9 用于RT-PCR反应的引物浓度为20 mol/L，其序列如下： 上游引物F：5- GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC -3 下游引物R：5- CAACCCAGACAACTCCATCTA -3 6.10 反转录酶：AMV反转录酶（5 U/L）。 6.11 反转录引物：Oligo
7、 dT-Adaptor Primer（2.5 mol/L）。 6.12 阴性对照：DEPC水。 6.13 阳性对照：TGEV细胞培养物。 6.14 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。 6.15 TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。 6.16 溴化乙锭。 6.17 DL2000 DNA Marker。 注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 DB21/T 23252014 3 7.1.2 采样工具
8、 药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（2） 高压灭菌15 min；剪刀、镊子经160 干热灭菌2 h。 7.1.3 肠内容物的采集与前处理 采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15 mL灭菌离心管中，按 1 ：5 倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用，待检。 7.1.4 粪便的采集与前处理 用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用，待检。 7.1.5 细胞培养物 细胞培养物冻融
9、3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。 7.1.6 存放与运送 采集或处理的样品在28 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在68 h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。 7.2 RT-PCR检测 7.2.1 RNA提取 在核酸提取室进行。 7.2.1.1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。 7.2.1.2 每管加入750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各
10、250 L，颠倒10次混匀，室温静置5 min；再加入250 L氯仿，混匀器上振荡混匀15 s（也可以用手反复颠倒混匀）。4 12000g离心15 min。 7.2.1.3 取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，加入500 L异丙醇(4 预冷)。取7.1.2中离心后的上清液约500 L转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15 min。 7.2.1.4 4 12000 g离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1 mL 75%乙醇。 7.2.1.5 4 12000 g离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。 7.2.1.6 4000 g离心10 s，用微量
11、加样器小心将残余液体吸干，室温干燥310 min。 7.2.1.7 加入18 L经DEPC处理的水和2 L RNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行RT-PCR扩增；于-70 冰箱长期保存。 7.2.2 反转录 7.2.2.1 反转录体系 DB21/T 23252014 4 建立10 L的反应体系，按下列组分加入离心管中： MgCl2 2 L 10RT Buffer 1 L RNase Free dH2O 2.75 L dNTP Mixture(各10mM) 1 L RNase Inhibitor 0.25 L AMV Reverse Trans
12、criptase*1 0.5 L Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 L 实验样品RNA 2 L 7.2.2.2 反转录条件 42 1 h；95 5 min；5 5 min。 7.2.3 PCR 7.2.3.1 PCR反应体系 建立50 L的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中： 5PCR Buffer 10 L 灭菌蒸馏水 27.75 L HS Taq DNA聚合酶 0.25 L 上游特异性PCR引物 1 L 下游特异性PCR引物 1 L 反转录产物 10 L 7.2.3.2 PCR反应条件 94 预变性3 min；94 变性30 s，53 退火30 s，72 延伸
13、50 s，35个循环；72 终延伸10 min。 7.2.3.3 电泳 将PCR扩增产物6L与1L上样缓冲液混合，点样于1.2%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为1TAE，以5 V/cm电压电泳25 min。 8 结果判定 紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在 276 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现276 bp扩增条带为TGEV核酸阳性，未出现276 bp扩增条带的样品判为TGEV核酸阴性。 DB21/T 23252014 5 图注： MDL2000 DN
14、A Marker，N阴性对照，P阳性对照，1、3、5阳性样品，2、4阴性样品 图1 PCR扩增产物电泳检测结果 DB21/T 23252014 6 附 录 A （规范性附录） A.1 0.02 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H20） 71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。 A.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H20） 31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。 A.1.3 量取0.2 moL/L
15、磷酸氢二钠溶液360 mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140 mL，称取氯化钠38 g，用无离子水溶解稀释至5000 mL，4保存。 A.2 电泳缓冲液（50倍） A.2.1 0. 5 mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8. 0） 二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.2.2 TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50倍） 羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8. 0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.3 1.2%琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级） 1.2 g TAE电泳缓冲液（50倍） 2 mL 灭菌双蒸水 98 mL 微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液10 L。 A 录C（规范性附 _
