1、1,实验室系列培训之二 高效液相色谱法操作注意事项,江西同和药业有限责任公司JiangXi Synergy Pharmaceutical CO.,LTD,2,前言,产品检测结果的准确与否，关键在于所用 的分析方法的准确性及日常操作遵循标准操作 程序的程度，做为检验人员，我们所能掌控的 因素主要是日常工作操作程序的把关，所以， 对于我们来讲，SOP就是我们检测所要参照的 主要依据，按部就班的执行，这样，才会将操 作过程产生的系统误差值降为最低限。,3,HPLC有以下优点（1）,高压压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速流速为0.110.0 ml/min
2、。 高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。,4,HPLC有以下优点（2）,速度快通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 柱子可反复使用用同根色谱柱可分离不同的化合物。,5,基本概念与术语（1）,色谱图：样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。 基线：经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音：基线信号的波动。因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相
3、含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移：基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,6,基本概念与术语（2）,色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线。不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰。 拖尾因子（T）：用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子或不对称因子。中国药典规定T应为0.951.05。其中：T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。,7,基本概念与术语（3）,峰底：基线上峰的起点至终点的距离。 峰高：峰的最高点至峰底的距离。 峰宽：峰两侧拐点
4、处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽：峰高一半处的峰宽。 标准偏差（）：正态分布曲线x1时的峰宽之半。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。,8,基本概念与术语（4）,峰面积：峰与峰底所包围的面积。 死时间（t0）：不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 死体积（V0）：由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积 柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据）柱出口管路体积检测器流动池体积。,9,基本概念与术语（5）,保留时间（tR）：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积（VR
5、）：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。 调整保留时间（tR）：扣除死时间后的保留时间。 调整保留体积（VR）：扣除死体积后的保留体积。 理论塔板数（N）：用于定量表示色谱柱的分离效率。N与柱长成正比，柱越长，N越大。,10,基本概念与术语（6）,容量因子（k）：化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。 分离度：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。中国药典规定R应大于1.5。 R1.5称为完全分离。,11,HPLC系统,HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检
6、测器是关键部件。 有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。,12,输液泵（1）,泵的构造和性能 特点：恒压泵受柱阻影响，流量不稳定 。螺旋泵缸体太大。这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。,输液泵,恒流泵,恒压泵,螺旋注射泵,柱塞往复泵,膈膜往复泵,13,输液泵（2）,输液泵应具备如下性能 流量稳定：其RSD应0.5%，这对定性定量的准确性至关重要。 流量范围宽：分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调 。 输出压力高：一般应能达到150300 kg/cm2。 液缸容积小。 密封
7、性能好，耐腐蚀。,14,输液泵（3）,泵的使用和维护注意事项 防止任何固体微粒进入泵体。 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力 。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡 。,15,输液泵（4）,输液泵出现故障，须查明原因，采取相应措施排除故障 没有流动相流出，又无压力指示 。 压力和流量不稳。 压力过高 。,16,洗脱（1）,分类,洗脱,梯度,等度,低压梯度（外梯度）,高压梯度（内梯度）,17,洗脱（2）,等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持
8、恒定。 适应范围：组分数目较少，性质差别不大的样品 梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相的组成。 适应范围：组分数目多、性质差异较大的复杂样品。 优点：可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度。 缺点：常常引起基线漂移和降低重现性。,18,洗脱（3）,在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始
9、状态。,19,色谱柱（1）,组成：柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝组成。 分类：常规分析柱：内径25mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长1030cm。窄径柱：内径12mm，柱长1020cm。 毛细管柱：内径0.20.5mm。,20,色谱柱（2）,色谱柱的清洗 正相柱：以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。其中：甲醇能洗去残留的强极性杂质。已烷使硅胶表面重新活化。 反相柱：以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。其中：一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质。,21,色谱柱（3）,阳离子交
10、换柱 ：用稀酸缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、 甲醇、水依次冲洗。 阴离子交换柱 ：用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。,22,色谱柱（4）,柱的使用和维护注意事项 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 应逐渐改变溶剂的组成。 色谱柱不能反冲。 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。 保
11、存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。 色谱柱使用过程中，如果压力升高的处理办法。,23,检测器（1）,检测器分类 按工作原理区分 按测量性质区分 按检测方式区分,24,检测器（2）,检测器性能 噪音和漂移 ：在仪器稳定之后，记录基线1小时基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。 灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。 线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围。 池体积 ：大多数HPLC检测器的池体积都小于10l 。,25,检测器（3）,检测器有关的故障及其排除 流动池内有气泡：噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰
12、” 。 流动池被污染：可能产生噪音或基线漂移 。 光源灯出现故障：可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不能回零。 倒峰,26,流动相（1）,流动相的性质要求 流动相应不改变填料的任何性质。 纯度。 必须与检测器匹配。 粘度要低（应2cp）。 对样品的溶解度要适宜。 总之：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘 度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。,27,流动相（2）,流动相的选择 溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关 。 正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加。流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱 。流动相通常以水作基
13、础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。,28,流动相（3）,流动相的pH值 通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离增加组分在固定相上的保留。 流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。,29,流动相（4）,流动相的脱气 必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。 气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳）。 溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。 溶解气体还会引起溶剂
14、pH的变化，对分离或分析结果带来误差。,30,流动相（5）,常用的脱气方法及注意事项 加热煮沸、抽真空、超声、吹氦。 离线（系统外）脱气法 在线（系统内）脱气法 混合溶剂：易采用超声脱气 ，不易采用抽气或煮沸法（考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化）。 超声脱气：应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。,31,流动相（6）,流动相的滤过及注意事项 所有溶剂使用前都必须经0.45m（或0.22m）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。 用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。 对于混合流动相，可
15、在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。,32,流动相（7）,流动相的贮存及注意事项 贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。 贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存，如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。 容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,33,运行系统评估,系统适应性评估 峰面积相对标准偏差（RSD） 峰保留时间相对标准偏差（RSD） 分离度 拖尾因子 理论塔板数 系统准确性评估 标准溶液2的回收率 系统稳定性评估 进样序列中所有标准溶液1峰面积相对标准偏差,34,如有问题、困难，需帮忙指导者，请与我联系。 联系人：李培祥 联系电话：13576589301； 3017（集团网） 网址： ； 谢 谢,
