1、Signal ReagentBiotinylated rabbit anti-HIV-1 p24 antibodiesMouse anti-HIV-1 p24 antibodiesSample HIV-1 p24 AntigenHRP Conjugated StreptavidinAbsorbanceMicrowell人类免疫缺陷病毒 1 型 p24 抗原酶联免疫试剂盒说明书【产品名称】通用名：人类免疫缺陷病毒 1 型 p24 抗原酶联免疫试剂盒英文名：ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I
2、 P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT【包装规格】96 人份/盒。【预期用途】本试剂盒用于人类免疫缺陷病毒 1 型 p24 抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的定量检测，适用于人血清（或血浆）及细胞培养上清液等标本，仅供研究使用。【检验原理】本产品采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA ）检测人血清（或血浆）中的游离 HIV-1 p24 抗原和细胞培养上清液等标本中的 H
3、IV-1 p24 抗原。本分析方法是基于双抗体夹心的非竞争性免疫分析。校准品和样品中 HIV-1 p24 抗原与固相抗- p24 单克隆抗体和生物素标记的抗- p24 多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗 -p24 单克隆抗体 p24 抗原抗-p24 多克隆抗体-生物素复合物；温育后洗涤，洗去非特异或多余的抗原和多余的生物素标记的抗- p24 多克隆抗体；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗- p24 单克隆抗体p24 抗原抗-p24 多克隆抗体-生物素链亲和素-HRP 复合物；温育后洗涤，洗去多余的 HRP 标记的链亲和素。加
4、入 TMB-H2O2 底物溶液，HRP 催化 H2O2 氧化 TMB 生成蓝色的产物（最大吸收峰 655nm），加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰 450nm）。其吸光度与校准品和样品中的 HIV-1 p24 抗原浓度成正相关。通过剂量反应曲线可得出样品中 HIV-1 p24 抗原浓度。试验类型 温育时间 试验所需时间 试验温度 试验所需样本体积免疫度量分析 120 分钟 大约150分钟 37C 和室温（1830 ） 75L反应原理图：【主要组成成份】1. 抗体包被板（Antibody Coated Microplate）1 块 包被有鼠抗-HIV-1 p24 单克隆抗体的聚苯
5、乙烯微孔板，约 200ng/孔。8 孔12 条。铝箔袋密封包装，含干燥剂。标签编号为 R1。2. HIV-1 p24 抗原校准品（HIV-1 p24 Antigen Calibrator）1mL1 支 重组 HIV-1 p24 抗原溶液，200IU/mL（约相当于4,000pg/mL） ，稀释液为校准品稀释液。用英国国家生物标准与检定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)提供的WHO 标准品（ HIV-1 p24 Antigen 90/636）校准。绿色 PP 盖子和无色 PP 塑料管。标签编号为R2。
6、3. 校准品稀释液（Calibrator Diluent）20mL1 瓶 磷酸盐缓冲液，含动物血清和钙化的正常人血浆（经 ELISA 检测，HBsAg、抗-HCV 和抗-HIV 1+2 均为阴性） ，pH 约 7.3。防腐剂为 NaN3（不超过 0.1%）和 EDTA。绿色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R3。4. 生物素标记抗体（Biotinylated Antibody）5mL1 瓶 生物素标记的兔抗-HIV-1 p24 多克隆抗体，约4g/mL。缓冲液为 Tris-HCl，含动物血清、稳定剂、表面活性剂和绿色染料，pH 约 7.4。防腐剂为 NaN3（不超过 0.1%）
7、。蓝色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R4。5. HRP 标记链亲和素（HRP Conjugated Streptavidin）20mL1 瓶 HRP 标记链亲和素，约 0.1g/mL（25mU/mL HRP） 。缓冲液为 Tris-HCl，含动物血清、稳定剂、表面活性剂和红色染料，pH 约 7.4。防腐剂为ProClin300（不超过 1%） 。红色 PP 盖子和棕色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R5。6. 浓缩洗涤液（Concentrated Wash Buffer）50mL1 瓶 含表面活性剂的磷酸盐缓冲液，20 倍浓缩。防腐剂为 ProClin300（不超过 1%） 。
8、无色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R6。7. 底物缓冲液（Substrate Buffer ）10mL1 瓶 含 H2O2 的乙酸盐缓冲液，pH 约 5.0。无色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R7。8. 显色剂（Chromogen Solution）10mL1 瓶 含 TMB 的乙酸溶液，pH 约 3.0。白色 PP 盖子和棕色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R8。9. 终止液（Stop Solution）10mL1 瓶 2mol/L H2SO4 溶液。黄色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R9。10. 封板膜（Plate Sealer）6 张
9、用于温育时微孔板的密封。11. 说明书（Instruction for Use）1 份 本产品使用说明。【储存条件及有效期】试剂盒置 28保存，有效期为 12 个月。【适用仪器】酶标仪、洗板机、恒温培养箱等。【样本要求】1. 样本：人血清（或血浆）样本，和细胞培养上清液等标本。2. 存放：样本于 28可储存 2 天；样本长期储存应放置于-20或-20以下环境中，且不宜反复冻融5 次以上。【检验方法】1. 试剂配制方法A、 HIV-1 p24 校准品系列的配制：取 6 支离心管，编号 A、B、C、D、E 和 F。管 F 中取 900L 校准品稀释液，加入 100L HIV-1 p24 校准品（2
10、00IU/mL ，4,000pg/mL） ，混匀，作 1:10 稀释，配制成校准品 F（20IU/mL，400pg/mL） ；管 E 中取 500L 校准品稀释液，加入 500L 校准品 F，混匀，作 1:2 稀释，配制成校准品E（10IU/mL ， 200pg/mL） ；管 D 中取 500L 校准品稀释液，加入 500L 校准品 E，混匀，作 1:2稀释，配制成校准品 D（5IU/mL，100pg/mL） ；管 C 中取 500L 校准品稀释液，加入 500L 校准品D，混匀，作 1:2 稀释，配制成校准品 C（2.5IU/mL ，50pg/mL） ；管 B 中取 500L 校准品稀释液，
11、加入 500L 校准品 C，混匀，作 1:2 稀释，配制成校准品 B（1.25IU/mL，25pg/mL） ；以校准品稀释液作为校准品 A。共配制成 6 个浓度的 HIV-1 p24 校准品系列（A-F ）：A 0、B 1.25IU/mL（25pg/mL） 、C 2.5IU/mL（50pg/mL） 、D 5IU/mL（100pg/mL） 、E 10IU/mL（200pg/mL）和 F 20IU/mL（400pg/mL） 。配制好的 HIV-1 p24 校准品系列应保存在28C，于一月内使用。校准品浓度 离心管编号 校准品稀释液 加入20IU/mL（400pg/mL）F 900L 100L R2
12、10IU/mL（200pg/mL）E 500L 500L 管 F5IU/mL（100pg/mL ） D 500L 500L 管 E2.5IU/mL（50pg/mL ） C 500L 500L 管 D1.25IU/mL（25pg/mL）B 500L 500L 管 CB、 工作浓度洗涤液的配制：用纯水（蒸馏水或去离子水）将浓缩洗涤液稀释 20 倍，即为工作浓度洗涤液。工作浓度洗涤液应保存在 28，于一月内使用。2. 标准操作方法A、 从铝箔袋中取出所需数量的微孔板条，装至微孔板架上。设空白对照 1 孔，HIV-1 p24 校准品A、B、C 、D 、E 和 F 各 2 孔，其余各孔为待测样品，建议每
13、个待测样品均设置 2 孔；编号标记。向各孔内分别加入 25L 的生物素标记抗体（空白对照孔不加） ，然后再向各孔内分别加入 75L的 HIV-1 p24 校准品或待测样品，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。B、 用封板膜将微孔板密封，置 37温育 60 分钟。C、 弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入 350L 工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共 5 次，最后拍干。D、 每孔加 HRP 标记链亲和素 100L（空白对照孔不加） ，用封板膜将微孔板密封，置 37温育 30分钟。E、 弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入 350L 工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去
14、。重复洗板共 5 次，最后拍干。F、 每孔加底物缓冲液和显色剂各 50L（含空白对照孔） ，用封板膜将微孔板密封，置室温（1830）避光温育 30 分钟。G、 每孔加终止液 50L（含空白对照孔） ，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。H、 终止反应后 1 小时内，用酶标仪在 450nm 波长处，测定各孔吸光度值，参考波长选择 620-700nm。3. 数据处理A、 求出 HIV-1 p24 抗原校准品的吸光度平均值。B、 以 HIV-1 p24 抗原校准品的吸光度平均值为纵轴，以 HIV-1 p24 校准品的浓度为横轴，在双对数坐标图上作出标准曲线。C、 如果待测样品试验了 2 孔，求出待测样
15、品的吸光度平均值。D、 将测得的样品的吸光度值（或吸光度平均值）在上述标准曲线上求出样品中的 HIV-1 p24 抗原的浓度。也可以通过软件用最小二乘法拟合曲线，求出样品中的 HIV-1 p24 抗原的浓度。【检验结果的解释】 1. 质量控制：空白对照校准品吸光度值不高于 0.050，A 点（0pg/mL）吸光度值不高于 0.100，F 点（400pg/mL）吸光度值不低于 1.000。2. 对于吸光度值超出校准品 F 点的样品，可用校准品稀释液稀释适宜倍数后再行测定，样本中 HIV-1 p24 抗原浓度值为稀释后测定值稀释倍数。【检验方法的局限性】1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。
16、2. 本品仅适用于游离的 HIV-1 p24 抗原含量的检测，不能用于总抗原含量的检测。3. 样本 pH 应保证在 5-10 之间，过低或过高的 pH 可能会造成 HIV-1 p24 抗原的测量值异常。【产品性能指标】1. 测定范围：0400pg/mL。2. 分析灵敏度：最低检测限不高于 5pg/mL。3. 校准品剂量-反应曲线的线性：线性相关系数 R0.9900。典型校准曲线如下图4. 精密性：批内变异系数（Within-Run CV）不高于 10%，批间变异系数（Between-Run CV）不高于15%。5. 特异性：与 HIV-1 和 HIV-2 的 env 蛋白、pol 蛋白和 ga
17、g 蛋白中的 p17（1 型）等无交叉反应。6. 胆红素（Bilirubin，20mg/dL ） 、血红蛋白（Hemoglobin ，500mg/dL ）和血脂（Triolein， 3,000mg/dL）对 HIV-1 p24 抗原的测量值无明显干扰。7. 抗凝剂（肝素 0.2mg/mL、柠檬酸钠 100mg/mL 和 EDTA 20mg/mL）对 HIV-1 p24 抗原的测量值无明显干扰。【注意事项】1. 本品仅适用于研究用途。2. 试剂盒从冷藏环境中取出，应平衡至室温（1830）后再使用。未用完的微孔条用自封袋密封保存。3. 储存和温育时应避光进行。4. 不得直接用手接触终止液。若不慎接
18、触则应立即用大量自来水冲洗。5. 操作应迅速，加样品时间过长、洗涤后放置太久均可能影响检测结果的准确性。6. 每次测定均应做标准曲线。7. 操作应按说明书严格进行。严格控制反应温度和时间，并尽量使用移液器加样，结果判定以酶标仪读数为准。8. 不同批号试剂请勿混用，不要使用过期试剂。9. 本品含有部分动物源性物质，操作必须符合国家有关传染性疾病检测的实验室管理及安全的规定，并按有关实验室规程处理所使用组份及样品。【参考文献】1. Allain, J.P., Laurian, Y., Paul, D.A., Verroust, F., Leuther, M., Gazengel, C., Senn
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