1、实验四 细菌的生理生化试验及肠杆菌科的鉴别、理化因素及生物因素对微生物的影响,一、目的要求,掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、方法、结果判定以及在诊断中的运用熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常 规微生物学诊断方法通过本实验加深理化因素及生物因素对微生物的影响的概念,二、实验材料,菌种：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巴氏杆菌培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、水琼脂斜面、氧化-发酵培养基（小生化管）、普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜面、各类生化反应管等器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等,三、
2、实验内容,1、细菌对空气（氧气）的需要 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 方法：用吸管将两种菌各加入两支己溶化的葡萄糖深层琼脂管中， 培养基：葡萄糖深层琼脂（己溶化）2、细菌对营养的要求 菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌 培养基：斜面（水琼脂、普通琼脂） 方法：划线的方法,（一）细菌的生理生化试验,3、细菌氧化型与发酵型（O/F）的测定菌种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：加有葡萄糖和指示剂（1%溴麝香草酚蓝）的微型发酵管方法：用接种针将两种菌各加入两支发酵管中，从不同菌里各取一管加入灭菌的液体石蜡，37 正置培养。 产酸（浅绿色 黄色 ）,4、淀粉水解试验 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：普通营养琼脂平板 方法
3、：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加碘液。5、触酶（过氧化氢酶）试验 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：普通营养琼脂平板 方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加H2O2,（二）肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌&沙门菌）,肠杆菌科的生化试验,1、麦康凯琼脂平板 （乳糖、胆盐、指示剂：1%中性红） 方法：划线，分解乳糖 菌落变红 2、三糖铁琼脂斜面 （葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂：0.5%酚红） 方法：先划斜面再穿刺,3、糖分解试验 微量发酵管：葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖 方法：用接种针挑取菌种后接入发酵管内，用报纸包
4、好口，置培养箱培养。发酵糖产酸：指示剂溴甲酚蓝由紫色 黄色4、吲哚（靛基质）试验 培养基：蛋白胨水微量管 原理：细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而成红色。 方法：接种针接种，培养12-24 h后，加入试剂显色,5、甲基红（MR）试验 培养基：葡萄糖蛋白胨水 原理：甲基红试验： 分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等使pH下降，含甲基红指示剂的培养基变红 6、VP试验：葡萄糖蛋白胨水 原理：某些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经多脱羧、氧化等反应生成二乙酰，其与蛋白胨中精氨酸胍基作用产生粉红色化合物,7、枸橼酸盐（柠檬酸盐）利用试验 培养基
5、：Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管 原理：细菌若能以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，则可利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成NH4OH，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草芬蓝由草绿色变为深蓝色。 8、脲酶 培养基：尿素微量发酵管（指示剂：酚红） 原理：细菌分解尿素产生2分子NH4，使pH升高，指示剂变红。,9、硫化氢试验 培养基：营养琼脂中含FeSO4的微量反应管 原理：凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。 10、运动力试验 培养基：半固体琼脂微量反应管 方法：穿刺接种,（三）理化因素及生
6、物因素对微生物的影响,1.紫外线与杀菌试验菌种： 大肠杆菌、枯草杆菌方法：取营养琼脂平板2个，一个涂大肠杆菌，另一个涂枯草杆菌。在其涂有细菌的表面贴上以剪出不同图案的硬纸片，然后在紫外灯下距离30厘米照射20分钟，照射完毕将硬纸片取走盖回原来平皿盖，于37培养24小时观察结果。,2.药敏试验：圆纸片扩散法菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养基：营养琼脂平板方法：,3.消毒剂抑菌和杀菌试验菌种：大肠杆菌、枯草杆菌方法：与药敏试验方法是一样的（纸片扩散法）,将以上接好细菌的培养基置37培养箱培养。 经1824h培养观察细菌生长情况。有一些生化管则需要加试剂后观察其颜色变化，做好实验结果记录并记录抑菌圈大小。,肠杆菌科细菌的鉴别,三糖铁琼脂斜面,斜面/底层,产气；H2S,糖发酵,葡萄糖,乳糖,蔗糖,甘露醇,MR,VP,靛基质,枸橼酸盐,脲酶,麦康凯,H2S,运动力,试验,结果,菌种,大肠杆菌,沙门菌,K / A,+(-) ; -,A=产酸（黄） K=产碱（红）,+ - +,
