1、 分子生物学实验课考核考试题库 1、PCR 原理是什么？2、PCR 一般体系应加入哪些试剂？3、PCR 防止其它 DNA 污染，应注意哪些问题？4、影响 PCR 产物产量的因素主要有哪些？5、引物设计应注意哪些问题？6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？ 7、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？8、质粒抽提实验中溶液 I、II、III 各有什么作用？9、碱裂解法抽提质粒 DNA 的基本原理是什么？10、在碱裂解法提取质粒 DNA 操作中应注意哪些问题？11、在碱裂解法提取质粒 DNA 时， 酚/氯仿的作用是什么？12、碱裂解法提取的质粒 DNA 分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异
2、？13、提取植物基因组 DNA 的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？14、在植物基因组提取过程中，DNA 降解的可能原因？15、在植物基因组提取过程中，提高 DNA 产量的措施？16、在使用苯酚进行 DNA 提取时应该注意什么？17、在提取植物基因组 DNA 过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？18、在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组 DNA 的质量？19、什么是限制性内切酶？20、常见的型限制性内切酶切割双链 DNA 后会产生 末端或 末端。21、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（ ）A一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性内切酶的活性受温度的影响
3、C限制性内切酶能识别和切割 RNAD限制性内切酶可以从原核中提取22、现有一长度为 l 000 bp 的 DNA 分子，用限制性核酸内切酶 EcoR I 酶切后得到的 DNA 分子仍是 l 000 bp，用 Kpn I 单独酶切得到 400 bp 和 600 bp 2 种长度的 DNA 分子用 EcoR I，Kpn l 同时酶切后得到 200 bp 和 600 bp 2 种长度的DNA 分子。请画出该 DNA 可能的酶切图谱。23、一个限制性内切酶的识别序列和切割位点是 5一 GGATCC 一 3，在质粒上有该酶的一个切点，请画出质粒被该限制性内切酶切割后所形成的黏性末端。24、基因工程中，切
4、割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是( )A可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端25、在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（ ）A. 目的基因的提取和导入B. 目的基因的导入和检测C. 目的基因与运载体结合和导入D. 目的基因的提取和与运载体结合26、在分子生物学实验中，常使用微量移液器，请说明在使用微量移液器时需要注意什么？27、现有量程为 0.1-2.5 l；1-10 l；2.5-20 l；10-200 l；100-1000
5、l的移液器各一支，请问，当吸取 0.15 l，0.5 l，5 l，15 l，100l，750 l液体时，各需要选取那种最佳量程范围的移液器？28、本学期我们学习了 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞和热休克法转化质粒DNA，你还知道哪些方法可以制备大肠杆菌感受态细胞和转化的方法？29、在质粒 DNA 转化大肠杆菌时，是如何进行筛选的？30、蓝白班筛选的原理是什么？31、在质粒 DNA 转化大肠杆菌感受态细胞时，如果将用来浸泡玻璃棒的酒精引燃起火该如何处理？32、卫星菌落出现的原因是什么？该如何避免？33、影响所制备感受态效率的因素有哪些？34、转化后为什么要温育 1 小时，为什么加入的是无抗
6、培养基？35、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？36、在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？37、在学习制备感受态细胞时，为什么要保证细胞密度12)的作用是破坏氢键,使 DNA 分子变性。溶液 III:由 KAc 与 HAc 组成,是 pH 值为5.5的高盐溶液.能中和溶液 II 的碱性,使染色体 DNA 复性而发生缠绕并使质粒 DNA 复性.K+离子会与 SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体 DNA 也会与蛋白质-SDS 形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒 DNA 分离,此外,高盐
7、溶液也有利于各种沉淀的形成。9.碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH 介于12.012.5时，线性 DNA 变性，双链打开，而质粒 DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当 PH 恢复到中性时，质粒 DNA 可迅速准确的完成复性，而线性 DNA 复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。10.（1）正确使用移液器。 （2）溶液 ll 必须新鲜配制。 （3）加入酚-氯仿后必须充分混匀。 （4）混匀的过程不能太过剧烈。 （5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。 （6）吸取酚-氯仿溶液时要将 Tip 头插入液体分层的下侧。 【可根据第
8、一次试验自己写的注意事项进行补充】11.酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质12. 超螺旋 DNA线性 DNA开环 DNA13.基本原理:利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的 SDS 溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA 酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的 DNA 溶液经异丙醇沉淀。注意事项:材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；操作应为无菌操作；操作应温和，不宜剧烈晃动；注意移液器的正确使用。 14.原因:从植物中提取
9、DNA 时没对细胞内的 DNA 酶进行灭活；操作过程中被细菌污染了；口水等含酶物质飞入样品中；温度、PH 等变化过于剧烈。15.应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的 DNA 含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免 DNA 被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用 EDTA 等防止 DNA 降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少 DNA 片段被认为降解，因为过度振荡会使 DNA 断裂成小片段。16.酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断 DNA
10、；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚 氯仿，尽量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。17.用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。18.检测：琼脂糖凝胶电泳；保证 DNA 活性:用 EDTA 抑制 DNA 酶活性，从而保证 DNA 不被破坏。19限制性内切酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶，有三种类型，类，类，类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能，类常用于分子克隆20.粘性，平21.C 22.实验课见黑板上23,-G GATCC-写在上面，下面为 -CCTAG G- 该酶为限制性内切酶 I24，A
11、25：D 26：1.确定合适的量程，不可超过量程取液。2.取液时按到第一档，Tip 头垂直进入液面3-5 毫米取液。移液器注意不能接触溶液。3.打出液体时贴壁并有一定角度，要按到第二档将液体全部压出。4.使用完毕后，打下 tip 头，放好移液器。27. 分别是 0.1-2.5 ，0.1-2.5 ，1-10， 2.5-20， 10-200， 100-1000。28，氯化铷法，甘油 聚乙二醇法，一步法 29题.因为质粒 pETBlue-2带有青霉素抗性基因,所以转化成功的大肠杆菌细胞能在含羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长形成菌落.所以用含羧苄青霉素的琼脂糖平板可以筛选出转化成功的大肠杆菌. 30.见实
12、验指导92面的实验原理的后半部分! 31.用水打湿的毛巾，着火时用毛巾盖上就行了32.（1）卫星菌落是氨苄降解后生长的杂菌 。可能是感受态细胞的问题也可能是转化过程出现操作失误例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间1216h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:31:10.（2）可以将培养时间控制在12h-16h 之间 ，或者更换抗生素为羧苄青霉素33：影响因素有（1）大肠杆菌生长状态（2）氯化钙浓度（ 3）冰上放置时间（4）保存温度34题、第一问：温育就
13、是让感受态恢复一下状态，以及一些相关抗性基因的表达。毕竟从-70环境中取出，需一段时间适应才可转化。第二问：因为细胞比较脆弱，加无抗培养基是为了让细胞生长，促使在转化过程中获得的新表型得到表达。 35.（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂 DNA 的污染 （2）细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落 （3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长 （4）一些实验误差，错将菌液放错36.实验组中长出菌落 而对照组中无任何菌落生长37.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，密度过高或不足均会影响转化效率，一次要保证细胞密度108/
14、 ml。甘油的目的是为了防止水在冻结过程中产生过大的冰晶损伤细胞，抑制大肠杆菌生长，以便保存。38.（主观题，言之有理即可，例：凝胶电泳，PCR 扩增等）39. DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。40.琼脂糖凝胶电泳时戴一次性手套能够有效阻止 EB 的渗入EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套 41、DNA 带负电荷，在电场中向正极移动42.电压越大速率越大。DNA 分子量越小速率越大。DNA 的分子结构：超螺旋最快，线型次之，开环最慢。介质的种类和浓度。EB 电泳缓冲液43，恒定电场强度下的琼脂糖凝电泳。 糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应，所以恒定场的琼脂糖凝胶电泳适于分离60kb_100kb 的DNA 片段，DNA 片段的迁移率和分子的大小和高级结构有密切关系。44、上清液 沉淀物45.无水乙醇的为了是沉淀 DNA 继而达到浓缩 DNA 的目的，70的乙醇是为了洗涤 DNA,进一步除去杂质。
