1、ICS 65.020.20B05备案号： DB 32江 苏 省 地 方 标 准DB 32/ T XXXXXXXX红花石蒜组培快繁技术规程Technical regulation for tissue culture of Lycoris radiata（报批稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T XXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由江苏省中国科学院植物研究所提出并归口。本标准由江苏省中国科学院植物研究所负责起草。本标准
2、主要起草人：汪仁、江玉梅、贺佳、徐晟、李晓丹，李宜奎，夏冰，彭峰。DB32/T XXXXXXXX1红花石蒜组培快繁技术规程1 范围本标准规定了红花石蒜（Lycoris radiata）外植体采集与处理、培养基配置、外植体接种、组织培养、炼苗移栽、移栽苗管理和记录等技术要求。本标准适用于红花石蒜组培苗的生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6001 育苗技术规程LY/T 1000 容器育苗技术3 外植体采集与处理3.1 外植体采集3.1.1 在
3、3月10月选择晴天的天气，采集表面无损的鳞茎作为外植体。3.1.2 将红花石蒜周围约30cm的土壤挖开，用手刨出鳞茎球，拨掉球茎所带的泥土。采集完球茎后，覆土填平。3.2 外植体处理3.3.1 剪去红花石蒜鳞茎球根部，剥去外层鳞茎片，带鳞茎盘切成长为 2cm3cm 的鳞茎片，放入烧杯中用 1%洗衣粉溶液浸泡 5min，然后流水冲洗 1h2h，最后用蒸馏水冲洗，转至超净工作台。3.3.2 在超净工作台上，用配制好的 75%乙醇浸泡 30s，然后用无菌水冲洗 2 次3 次。3.3.3 配制终浓度为 1%的次氯酸钠消毒液，用其浸泡材料 30min 后，用无菌水冲洗 5 次6 次，并用无菌滤纸吸干水分
4、后备用。4 培养基配制4.1 MS 培养基母液配制4.1.1 制作培养基前需先配制培养基母液，MS 培养基母液配制比例参见附录 A。4.1.2 母液配制应用蒸馏水。4.1.3 配制大量元素母液时，每个组分单独溶解，避免沉淀发生。DB32/T XXXXXXXX24.1.4 配制后的母液应置于 4冰箱中冷藏保存，微量元素母液用棕色瓶盛装保存，母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过 3 个月。4.1.5 母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现母液中有沉淀或絮状物出现应停止使用。4.2 植物生长调节物质母液配制植物生长调节物质母液的配制浓度为 0.5mg/mL，其配制方法参见附录 B。母液配制
5、好后滤膜过滤除菌，滤液贴好标签并置于 4冰箱中冷藏，保存期不超过 3 个月。4.3 培养基选择诱导培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L；增殖培养基：MS+6-BA 5.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L；生根培养基：MS+IBA 1.0mg/L。4.4 培养基制作4.4.1 准备好配制容器（1L 烧杯、玻璃棒和量筒）、蒸馏水、琼脂粉、蔗糖和各类母液等。4.4.2 先用烧杯盛有少量蒸馏水，参考用量参见附表 A。4.4.3 按蔗糖浓度 30g/L 计算用量，称量后用蒸馏水溶解，然后用容量瓶定容。 4.4.4 根据培养基的选择加入植物生长调节物
6、质，玻璃棒搅拌均匀。用 pH 计测试酸碱度，调节 pH 值至 5.65.8。4.4.5 将称量好的琼脂粉（6g/L7g/L）加入烧杯中加热搅拌至完全溶解。4.4.6 分装时，不应将培养基倾倒在培养瓶瓶口。分装后立即用瓶盖盖上，并旋紧。4.5 培养基灭菌4.5.1 将分装好的盛有培养基的培养瓶放入高压蒸汽灭菌锅内。打开冷凝阀，排尽灭菌锅内的冷空气。当气压达到 0.1Mpa、温度升至 121时开始计时，保持温度并进行压力灭菌 20min。4.5.2 关闭灭菌锅电源，以慢排方式排放热气。待灭菌锅内的气压表指针降至 0 时再打开高压灭菌锅盖，取出培养基。将培养基平放置于接种室或培养室内进行冷却。4.6
7、 培养基保存灭菌后的培养基应注明培养编号及配制日期，同时按培养基种类、配制先后顺序分别储存于接种室或培养室。储存时间不宜超过 2 周。5 外植体接种5.1 接种环境接种前，接种室和超净工作台内要进行紫外线消毒20min30min，操作人员关闭紫外灯并通风15min后再进行操作。操作时应佩戴一次性乳胶手套，并在进入超净台前用 75%乙醇喷洒消毒。接种结束后，应及时清理接种室和超净工作台及杂物。5.2 接种DB32/T XXXXXXXX35.2.1 将接种工具（手术刀和镊子）用牛皮纸包好，放入高压蒸汽灭菌锅内，按照 4.5 的方法，进行高压灭菌。将灭菌好的接种工具放入 65烘箱中干燥 24h，喷洒
8、 75%的乙醇表面消毒后立即转移至超净工作台。每转接完一个培养瓶中的培养材料，均应将接种工具放在酒精灯外燃火焰上灼烧 10s，同时更换接种器皿中的滤纸，以避免交叉污染。5.2.2 在无菌的培养瓶中，将消毒处理后的鳞茎小块接种于诱导培养基上，每瓶接种 1 块2 块。接种完成后，用记号笔在培养瓶上标注接种日期、编号或名称。5.2.3 每次接种完毕后，应用75%的乙醇将超净工作台的台面及两边挡板等擦拭干净，同时将接种器皿及接种工具重新按照5.2.1的方法进行灭菌消毒处理。6 组织培养6.1 培养条件培养室内温度为 242，培养瓶上部的光照强度为 100mol-1m-2s-1150mol-1m-2s-
9、1，光照时间为每天 12h16h。6.2 诱导培养将已消毒的鳞茎小块接种在诱导培养基上，15d20d后芽开始萌发，25d左右茎尖变绿并伸长生长，40d左右芽可长高至2cm3cm。6.3 增殖培养将诱导培养形成的单个幼芽或丛生芽，接种到增殖培养基上进行培养。增殖培养周期约为30d。 6.4 生根培养将增殖培养后的丛生芽切割成单个完整的幼芽，并使其基部插入生根培养基中，进行生根培养2周3周。 7 炼苗移栽7.1 炼苗选取株高大于3cm，根长1cm4cm，且形成小鳞茎的组培苗放置温室自然散射光下，打开瓶盖，加注少量无菌水（水深0.5cm左右）炼苗2d3d，控制温度在1828，湿度控制在70%80%。
10、7.2 移栽7.2.1 移栽基质泥炭土与珍珠岩比例为 2:1，并加入 0.5g/L 的多菌灵搅拌均匀，然后装入营养钵中压紧待用。7.2.2 用镊子将无菌苗从培养瓶中小心取出，注意保护根系，将根部粘附的琼脂用 3035清水清洗干净，移到营养钵中，用基质将根埋好。移栽后及时浇透水，外面用遮阳网罩着，避免阳光直射。DB32/T XXXXXXXX48 移栽苗管理和记录8.1 水分管理在遮荫且通风条件下培养2d3d，向叶面喷水1次，2周后，撤掉遮荫，但要注意通风。此后，每隔2周3周浇水1次。8.2 大田移栽时间移栽苗移栽完成2个月以上于当年秋季或翌年春季移栽至大田。8.3 记录应建立完整、真实的组培栽培
11、管理记录档案，档案保存 2 年以上。DB32/T XXXXXXXX5A A附 录 A（资料性附录）MS 培养基母液配制表表 A.1 MS 培养基母液配制表母液 化合物 原配方量(mg.L-1) 扩大倍数 称取量（mg） 母液体积（mL ） 配制 1L 培养基应吸取量（mL）NH4NO3 1650 33000KNO3 1900 38000CaCl22H2O 440 8800MgSO47H2O 370 7400大量元素KH2PO4 1702034001000 50KI 0.83 166H3BO3 6.2 1240MnSO44H2O 22.3 4460ZnSO47H2O 8.6 1720NaMoO4
12、2H2O 0.25 50CuSO45H2O 0.025 5微量元素CoCI26H2O 0.02520051000 5FeSO47H2O 28.7 5560铁盐Na2.EDTA2H2O37.320074601000 5肌醇 100 20000烟酸 0.5 100盐酸吡哆醇 0.5 100盐酸硫胺素 0.1 20维生素和氨基酸甘氨酸 2.02004001000 5DB32/T XXXXXXXX6B B附 录 B（资料性附录）常用植物生长调节物质配制表表B.1 常用植物生长调节物质配制表化学试剂名称 分子式或英文名 配制方法 配制浓度（mg/mL）6-苄氨基嘌呤（6-BA）6-Benzylaminopurine 先用少量 1ml/L 的盐酸溶解，然后加蒸馏水定容。0.5mg/mL萘乙酸（NAA） 1-Naphthaleneacetic acid先用少量 0.1mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。0.5mg/mL吲哚丁酸（IBA） Indole-3-butyric acid先用少量 0.1mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。0.5mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸 2,4-dichlorophenoxy 先用少量 0.1mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。0.5mg/mL_
