1、常见问题 具体情况可能的原因处理办法 备注抗性不对或菌已死核对抗性，尽可能提供载体信息。菌培养不好或失败 或菌培养条件特殊重新提供菌液，或提供 2ug 纯化质粒。质粒拷贝数极低或质粒提不出培养方式不当客户自己采取大量提取的方法提供2ug 纯化质粒。低拷贝数质粒或质粒产量很低培养方式不当客户自己采取大量提取的方法提供2ug 纯化质粒。是否为电泳法定量，质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于 20ul。样品准备问题自带质粒或已纯化 PCR产物量极低总量是否足够已纯化 PCR 产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。测 OD 值法不
2、可靠,电泳检测重复序列，如polyT、polyA 或几个碱基重复用反向引物测互补链。质粒测序在插入序列中出现套峰可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。PCR 产物测序中，某一点后序列变乱可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。PCR 产物中一个或多个位置有套峰序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。PCR 产物测序前部分双峰引物二聚体污染或产物不纯，克隆后测序。测序出现双峰或信号中断双峰质粒测序时整个结引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测此类问题主要与样品有关果双峰 序。质粒和PCR 产物测序出现双峰引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向 PCR
3、引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。模板 GC二级结构区后难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序模板 GT二级结构区后测反向互补序列，AC 结构不影响测序严重的重复结构测反向互补序列 信号迅速衰减或中断模板特性决定的根据具体情况决定 模板质量差重新提供菌液或纯化 PCR 产物 质粒样品：引物不符尽量提供载体详细信息，核查引物 引物不适宜测序测序引物比 PCR 引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的 PCR 引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对 PCR 产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序质粒产量极低客户自己提供 2ug 纯化好的质粒 信号极弱或无信号PCR 产物定量极低重新电泳检测已纯化的 PCR 产物，确认有足够的量，或提供 PCR 原液由公司进行纯化质粒模板检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。找不到引物PCR 模板不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。测序结果正常，与预期不符结果完全不对请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
