1、临床免疫学：一：免疫球蛋白免疫球蛋白的酶解片段 在一定条件下，免疫球蛋白分子肽链的某些部分易被蛋白酶水解为不同片段。木瓜蛋白酶水解 IgG 的部位是在铰链区二硫键连接的 2 条重链的近 N 端，可将 Ig 裂解为两个完全相同的Fab 段和一个 Fc 段.一个 Fab 片段为单价，可与抗原结合但不形成凝集反应或沉淀反应，Fc 段无抗原结合活性，是 Ig 与效应分子或细胞相互作用的部位。胃蛋白酶作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近 C 端，水解 Ig 后可获得一个 F（ab）2 片段和一些小片段 pFc。 F（ab）2 是可同时结合两个抗原表位，故与抗原结合可发生凝集反应和沉淀反应。pFc最终可
2、被降解，无生物学作用。 免疫球蛋白的类型 类：Ig 重链 C 区所含抗原表位不同，据此可将重链分为 、 链 5 种，与此对应的 Ig 分为 5 类，即 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。 亚类：同一类免疫球蛋白其重链的抗原性及二硫键数目和位置不同，据此可将 Ig 又可分为亚类。IgG 有 IgG1IgG4 四个亚类；IgA 有 IgA1 和 IgA2 两个亚类；IgM 有 IgM1和 IgM2 两个亚类；IgD 和 IgE 尚未发现亚类。 型：根据 Ig 轻链 C 区所含抗原表位的不同，可将 Ig 轻链分为 2 种： 和 ，与此对应的免疫球蛋白分为 和 两型。 亚型：同一型免疫球蛋白
3、中，根据其轻链 C 区 N 端氨基酸排列的差异，又可分为不同的亚型。 一、 IgG 血清含量最高，半衰期最长； 功能最多：结合抗原、激活补体、调理吞噬并介导 ADCC、通过胎盘、结合 SPA。 为再次免疫应答的主要抗体：抗感染的主要抗体( 抗菌、抗病毒, 抗毒素抗体),并介导 II、III 型超敏反应 二、 IgM 分子量最大，不能通过血管壁，主要存在于血液和粘膜表面。是血管内抗感染的主要抗体。在个体发育过程和体液免疫应答中均是最早合成和分泌的抗体。 脐带血 IgM 增高提示胎儿有宫内感染； 感染过程中血清 IgM 水平升高，说明有近期感染。 天然的血型抗体和类风湿因子亦属 IgM。其激活补体
4、的能力比 IgG 强。 膜表面 IgM 是 B 细胞抗原受体(BCR)的主要成分。只表达 mIgM 是未成熟 B 细胞的标志，记忆 B 细胞表面的 mIgM 逐渐消失。 三、IgA 血清型 IgA： 以单体形式存在。 分泌型 IgA(sIgA)： 由 J 链连接的二聚体和分泌片组成。合成和分泌的部位在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。是参与粘膜局部免疫的主要抗体。婴儿可从母亲初乳中获得分泌型 IgA，是一种重要的自然被动免疫。 四、 IgD 正常人血清 IgD 浓度很低，平均约 0。03mg/ml。半寿期很短（仅 3 天）。血清 IgD 的确
5、切功能仍不清楚。 B 细胞表面的 mIgD 可作为 B 细胞分化发育成熟的标志，未成熟 B 细胞仅表达 mIgM，成熟 B 细胞可同时表达 mIgM 和 mIg 五、 IgE 血清浓度极低，约为 510-5 mg/ml。IgE 为亲细胞抗体，与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力 FcRI 结合，引起 I 型超敏反应。含量由高到低：IgG IgM IgA IgD IgE二：补体补体结合试验中有 5 种成分参与反应，分属 3 个系统： 1.反应系统； 2.补体系统； 3.指示系统。 其中反应系统（抗原与抗体）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统。 如先加入反应系统和补体，给其以优先结合补体
6、的机会，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原、抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统（SRBL 与相应溶血素），由于反应中无游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。如待测系统中不存在待检的抗体或（抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原补体激活过程依据其起始顺序不同，可分为三条途径：从 C1q-C1r2-C1s2 开始的经典途径，抗原-抗体复合物为主要激活物；由病原微生物等提供接触表面，从 C3开始的旁路途径，其不依赖于抗体；通过甘露聚糖结合凝集素 MBL 医学教.
7、育网搜集整理糖基识别的凝集素激活途。补体经典激活途径的活化顺序为 Cl42356789三：免疫的概念1免疫防御（immunologicaldefence）指机体排斥外源性抗原异物的能力。这是动物藉以自净、不受外来物质干扰和保持物种纯洁的生理机制。这种功能一是抗感染，即传统的免疫概念；二是排斥异种或同种异体的细胞和器官，这是器官移植需要克服的主要障碍。这种能力低下时机体易出现免疫缺陷病，而过高时易出现超敏反应性组织损伤。2免疫自稳（immunololgicalhomeostasis）指机体识别和清除自身衰老残损的组织、细胞的能力，这是机体藉以维持正常内环境稳定的重要机制。这种自身稳定功能失调时易
8、导致某些生理平衡的紊乱或者自身免疫病。3免疫监视(immunologicalsurveillance)指机体杀伤和清除异常突变细胞的能力，机体藉以监视和抑制恶性促瘤在体内生长。一旦功能低下，宿主易患恶性肿瘤。四：超敏反应（速发型） （溶细胞型或细胞毒型） （免疫复合物型或血管炎型） （迟发型）抗体 IgE IgG 、IgM IgG 、IgM 无补体 无 来源:考试大网 有 有 无细胞 肥大、嗜碱（嗜酸） 单核细胞 中性粒、肥大、嗜碱、血小板 Th1、 CTL、单核代表疾病过敏性休克（药物、血清）；皮肤过敏反应（荨麻疹、湿疹、血管神经性水肿）；呼吸道过敏反应、消化道过敏反应输血反应、新生儿溶血症
9、、自身免疫性溶贫、药物过敏性血细胞减少症Arthus 反应、血清病、免疫复合物型肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎接触性皮炎等五：MHC 与 HLA主要组织相容性复合体（MHC）是一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因。MHC 编码的基因产物为主要组织相容性抗原（MHA）。 人类的 MHC 即 HLA 基因复合体位于人的第 6 对染色体的短臂上，是目前已知最复杂的人类基因系统。、三类基因。HLA 由 400 万碱基组成，传统上分为、三类基因。类：包括经典的 HLA-A、B、C，非经典的 HLA-E、F、G、H、X 等；类：包括经典的 HLA-DP、DQ、DR，非典型的 HLA-DN、
10、D0、DM 等；类：位于 HLA-、类之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。截止到 l999 年，已知的 HLA 等位基因数已超过 1000 个，且数量仍在继续增加 HLA 基因复合体所表达的基因产物，除直接构成同种异体移植排斥反应的靶抗原外，在免疫应答的过程中发挥着重要调控作用，也反映着自身免疫性疾病的基因易感性。 MHC 类分子可广泛地表达于各种组织的有核细胞上，其表达受到多种因素的调节，如IFN-、 等细胞因子可促进其表达；MHC 类分子不是表达于细胞表面的膜分子，而是分布于血清及其他体液中的可溶性分子六：移植免疫排斥反应有两种基本类型：宿主抗移植物反应（HVGR）和移植物
11、抗宿主反应（GVHR），临床上多见是前者；根据发生的机制、时间、速度和临床表现，HVGR 又可分为 3 种类型：超急排斥反应；急性排斥反应；慢性排斥反应。 超急性排斥反应 超急排斥反应发生在移植物与受者血管接通的数分钟到数小时内，出现坏死性血管炎表现，移植物功能丧失，患者有全身症状。发生的基本原因是受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统，导致血管内凝血。常见于下列情况：ABO 血型不符；由于多次妊娠或反复输血等使受者体内存在抗 HLA 抗体；移植物保存或处理不当等其他原因。超急排斥发生迅速，反应强烈，不可逆转；需立即切除移植物，否则会导致受者死亡。如果事先认真进行
12、ABO 基至 Rh 血型检查和交叉配合试验，多可避免这种现象的发生。 急性排斥反应 急性排斥反应是排斥反应最常见的一种类型，多发生在移植后数周到 l 年内，发生迅速，临床表现多有发热、移植部位胀痛和移植器官功能减退等；病理特点是移植物实质和小血管壁上有以单个核细胞为主的细胞浸润、间质水肿与血管损害，后期在大动脉壁上有急性纤维素样炎症。急性排斥出现得早晚和反应的轻重与供受者 HLA 相容程度有直接的关系，相容性高则反应发生晚、症状轻、有些可迟至移植后 2 年才出现。急性排斥反应经过及时恰当的免疫抑制治疗多可缓解。 急性排斥反应又分为两种。急性体液排斥反应：抗体激活补体，并有 CD4+T 细胞参与
13、，导致急性血管炎。急性细胞排斥反应：CD8 +CTL 细胞的细胞毒作用、CD4 +T 和巨噬细胞的作用，导致急性间质炎。慢性排斥反应 慢性排斥反应属于迟发型变态反应，发生于移植后数月甚至数年之后，表现为进行性移植器官的功能减退直至丧失；病理特点是血管壁细胞浸润、间质纤维化和瘢痕形成，有时伴有血管硬化性改变。其机制可能为急性排斥细胞坏死的延续；炎性细胞相关的慢性炎症；抗体和细胞介导的内皮损伤；管壁增厚和间质纤维化。本型反应虽然进展缓慢，但用免疫抑制治疗无明显的临床效果。 以上属宿主抗移植物反应（HVGR）。移植物抗宿主反应（GVHR）多发生于同种骨髓移植者，也可见于脾、胸腺和小肠移植中；此时患者
14、的免疫状态极度低下，而移植物中丰富的免疫活性细胞则将受者细胞视为非己抗原，对其发生免疫应答；移植物的 T 细胞在受者淋巴组织中增殖并产生一系列损伤性效应。GVHR 分为急性与慢性两型。急性型多见，多发生于移植后 3 个月以内，患者出现肝脾肿大、高热、皮疹和腹泻等症状；虽是可逆性变化，但死亡率较高；慢性型由急性型转来，患者呈现严重的免疫失调，表现为全身消瘦，多个器官损害，以皮肤和黏膜变化最突出，病人往往因严重感染或恶病质而死亡。 移植排斥反应的机制和过程与一般免疫应答相似，只是参与细胞是一种特殊类型的 Tc 细胞，称为同种反应型 Tc 细胞。这种 Tc 细胞能识别并杀伤遗传学上无关供体表达外来抗
15、原分子的移植物中的靶细胞，从而导致组织不相容移植物的排斥反应。造成排斥反应损伤效应的机制除 Tc 细胞介导的细胞毒作用外，尚有 NK 细胞介导的直接细胞毒作用和 ADCC、抗体介导的补体依赖性细胞毒作用和炎症效应以及细胞因子介导的系列炎症效应等。在不同情况下，各种机制分别参与的程度有所侧重，所以不同类型排斥反应的表现也不尽相同。 七：自身抗体的检测常见 ANA 荧光图形及临床意义如下： 1.均质型：多是由抗 DNP 抗体所引起。也可由核小体抗体和抗双链 DNA 抗体引起。主要见于 SLE，药物性狼疮。 2.斑点型：是由抗 ENA 抗体所引起。主要见于 SLE、MCTD、PSS、SS 等。高滴度
16、的斑点型常见于 MCTD。 3.周边型（又称核膜型）：主要由抗 dsDNA 的抗体所引起。主要见于 SLE。特别是活动期患者。 4.核仁型：主要见于硬皮病。相关抗体是抗核仁特异的低分子量 RNA 等。5.着丝点型：主要见于局限性硬皮病及 CREST 综合征。主要的靶抗原是着丝点 B 抗原。 抗 ENA 抗体谱的临床意义1.抗 Sm 抗体 抗 Sm 抗体仅发现于 SLE 患者中，是 SLE 的血清标志抗体，已列入 SLE 的诊断标 准。约 30%40%的 SLE 患者抗 Sm 抗体阳性，此抗体阴性不能排除 SLE 的诊断。相对抗dsDNA 抗体而言，抗 Sm 抗体水平不与 SLE 疾病的活动性相
17、关，亦不与 SLE 的任何临床表现相关，治疗后的 SLE 患者也可存在抗 Sm 抗体阳性。抗 Sm 抗体的检测对早期、不典型的SLE 或治疗后的回顾性诊断具有很大帮助。 2.抗核 RNP 抗体 抗核 RNP（nuclearRNP，nRNP）抗体是诊断 MCTD 的重要血清学依据，列入 MCTD 的诊断标准。因其抗原为含有 U1RNA 的核蛋白复合物，故而称为 U1RNP.其在 MCTD 患者的阳性检出率可高达 95%。无论在疾病的活动期或是缓解期，高滴度的抗 RNP 抗体均可持续存在。 抗 nRNP 抗体无疾病特异性，在其他自身免疫性疾病中阳性检出率如下：SLE3040，SS20，进行性系统性
18、硬化（PSS）1015，皮肌炎（PM）多发性肌炎（DM）10，偶尔也可见于 RA 和药物诱发的狼疮，不过滴度均较 MCTD 患者低。 由于 Sm 和 RNP 是同一分子复合物（RNA蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，两种抗原具有相关性，故抗 Sm 抗体阳性常伴有抗 RNP 抗体阳性，单一的抗 Sm 抗体或抗 RNP 抗体阳性较少见。 3.抗 SSARo 抗体和抗 SSBLa 抗体 抗 SSABo 抗体和抗 SSBLa 抗体是 SS 患者最常见的自身抗体。其阳性检出率分别是70%80%和 40%，而抗 SSBLa 抗体的特异性高于抗 SSARo 抗体，可达 50%60%。该两个抗体的同时检测可提高对
19、 SS 的诊断率。 部分 SLE 患者也有抗 SSARo 抗体和抗 SSBLa 抗体的检出，其阳性率分别为 35%和 15%左右。约 60%的亚急性红斑狼疮（SCLE）患者，补体缺陷的 SLE 患者和新生儿狼疮患者可出现抗 SSARo 抗体阳性。抗 SSA 抗体可通过胎盘进入胎儿，引起新生儿狼疮综合征，出现典型的 SLE 皮损和不完全性心脏传导阻滞。另外，单独出现抗 SSARo 抗体阳性的 SLE患者，其肾炎或血管炎的发生率较单独出现抗 SSBLa 抗体阳性的 SLE 患者高。因抗SSARo 抗体与 SSARo 抗原形成的免疫复合物，更易沉积于肾脏和血管壁，造成肾脏损伤及血管炎。 4.抗 Jo
20、1 抗体 该抗体最常见于多发性肌炎（polymyositis，PM），故又称为 PM1 抗体。具有抗 Jo1抗体特性的是分子量 110kD 和（或）80kD 的多肽（核仁蛋白）。抗 Jo1 抗体在 PM 的阳性检出率可达 40%50%，在 PMDM 患者的阳性检出率为 25，单独皮肌炎中的检出率不足 10%，在其他自身免疫性疾病中抗 Jo1 抗体为阴性，因而抗 Jo1 抗体对诊断 PM 具有特异性。PM 与硬皮病重叠的患者，抗 Jo1 抗体的阳性率可高达 85%，PSSPM 中为25，PM 伴肺间质纤维化者抗 Jo1 抗体阳性率可达 60%。 5.抗 Scl70 抗体 抗 Scl70 抗体几乎
21、仅在进行性系统性硬皮病（PSS）患者中检出，抗体相对应的抗原分子量为 70kD.故该抗体是 PSS 的特征抗体。在系统性硬化症的阳性检出率为 20%40%，在PSS 的阳性检出率为 40%60%。在其他自身免疫性疾病患者中极少有阳性检出，正常人均为阴性。八：酶免疫技术酶免疫技术的分类酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相和异相两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下：Ab*+ AgAb*Ag+Ab*Ab*Ag 代表结合的标记物， Ab*为游离的标记物。如在抗原反应
22、后，先把 Ab*Ag 与 Ab* 分离；然后测定 Ab*Ag 或 Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如在抗原抗体反应后 Ab*Ag 中的标记物* 失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行 Ab*Ag 与 Ab*的分离，可以直接测定游离的 Ab* 量，从而推算出标本中的 Ag 含量，这种方法称为均相法。在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有许多种。与放射免疫测定相类似的液相异相酶免疫技测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或
23、抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为 EL1SA 的检测技术成为目前临床检验中应用较广的免疫测定方法。方法类型和操作步骤ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有 3 种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，
24、让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使同相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法：在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操
25、作，缩短了反应时间，如果使用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA 提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应，类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体 ：间接法是检测抗体时最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗-抗体检测已与固相结合的受检抗体。故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的
26、特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如： 欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人 lgG 抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。（四）竞争法：竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与同相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检
27、抗原的量呈反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与同相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深，参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表于标本中抗原含量越多。（五）捕获法测
28、lgM 抗体血清中针对某些抗原的特异性 lgM 常和特异性 lgG 伺时存在，后者会干扰 lgM 抗体的测定。因此测定 lgM 抗体多用捕获法。先将所有血清 lgM（包括异性 lgM 和非特异性 lgM）固定在固相上，在除去 lgG 后再测定特异性 lgM。操作步骤如下：（1）将抗人 lgM 抗体连接在固相载体上，形成固相抗人 lgM。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的 lgM 抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性 lgM 结合。（4）加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合。（5）加底物显色：
29、如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 lgM 抗体存在，为阳性反应。（六）亲和素和生物素的 ELlSA：亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD，每个分子由 4 个亚基组成，可以和 4 个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素 H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素一羟基玻璃亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经
30、结合就极为稳定。由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与 ELIS 偶联起来，就可大大提高检测的灵敏度。早早孕胶体金标试条检测测 HCG 原理本检测试条以双抗体夹心法为基础，采用免疫层析金标记技术，快速检测尿液中的 HCG。两个抗人 -hCG 单克隆抗体，一个抗体吸附于硝酸纤维素薄膜（NC）上，另一个抗体结合于金溶胶颗粒表面。尿液中 hCG 先与 NC 膜上的抗体结合，然后再与金标单抗溶液反应，于是形成抗体-hCG-金标抗体的夹心式复合物，显现出红色的沉淀线。多余的金标记抗 HCG移行至 C 区时被抗小
31、鼠 IgG 抗体捕获，而显示出红色对照线条十：生物素-亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为 BAB 法；后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术（ABC）。另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的 BA 法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。此外，依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为医|学教育网搜集整理直接法 BAS 和间接法 BAS。 临床生物化学检验：一：血浆脂蛋白：1：分类：电泳法 ，pre-，CM (几乎停留在原点)正极 负极（原点）超
32、速离心法：CM,VLDL(pre-),LDL IDL(),HDL()2：人血浆脂蛋白的特征Variable CM VLDL IDL LDL HDL Lp(a)密度(g/ml) 70 2570 2224 1923 410 2530脂质:蛋白质比99:1 99:10 85:15 80:20 50:50 75:2564:36主要脂质 外源性 TG 内源性 TG 内源性TG、CE CE PL CE、PL主要载脂蛋白AIB48CICIICIIIB100CICIICIIIEB100EB100 AIAIID(a)B100合成部位 小肠粘膜细胞 肝细胞 血浆 血浆 肝、肠、血浆 肝细胞功 能 转运外源性 TG
33、 转运内源性 TG 转运内源性TG、CE 转运内源性 CE 逆向转运CE 未知3：人高脂蛋白血症分型及其特征型I 型a b 型 型 V 型增加的脂蛋白 LDL LDL VLDLIDL VLDL CM VLDL血浆脂质Ch/TGTC 正常或TG1.6TCTG1.0TCTG1TC 正常或TG0.61.6TC 正常或TG Km）时， Vmax，反应速度达到最大速度，再增加底物浓度也不再影响反应速度。（三） Km与 Vmax的意义（1）当酶促反应速度为最大速度的一半，即 v = Vmax/2 时，米氏方程式可以变换为：S2maxK进一步整理得 Km=S。由此可见， Km值等于酶促反应速度为最大速度一半
34、时的底物浓度。它的单位是 mol/L。当 pH、温度和离子强度等因素不变时， Km是恒定的。（2） Km是酶的特征性常数之一，在酶学及代谢研究中是重要的特征数据。 Km值的大小，可以近似地表示酶和底物的亲和力, Km值大,意味着酶和底物的亲和力小，反之则大。因此，对于一个专一性较低的酶，作用于多个底物时，不同的底物有不同的 Km值，具有最小的 Km或最高的 Vmax/Km比值的底物就是该酶的最适底物或称天然底物。 催化可逆反应的酶，当正反应和逆反应 Km值不同时，可以大致推测该酶正逆两向反应的效率， Km值小的底物所示的反应方向应是该酶催化的优势方向。 有多个酶催化的连锁反应中，如能确定各种酶
35、 Km值及相应的底物浓度，有助于寻找代谢过程的限速步骤。在各底物浓度相当时， Km值大的酶则为限速酶。 判断在细胞内酶的活性是否受底物抑制。 测定不同抑制剂对某一酶 Km及 Vmax的影响，可以用于判定该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂。必须指出，米氏方程只适用于较为简单的酶促反应过程，而对于比较复杂的酶促反应过程，如多酶体系、多底物、多产物、多中间物等，还不能全面地以此加以概括和说明，必须借助于复杂的计算过程。酶浓度对反应速度的影响在一定的温度和 pH 条件下，当底物浓度大大超过酶的浓度时，酶的浓度与反应速度呈正比关系，见图 3-2。pH 对反应速度的影响（1）酶分子的结构发生变化 酶
36、反应介质的 pH 可影响酶分子的结构，特别是活性中心内必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态。 （2）影响底物和辅酶的解离程度 从而影响酶与底物的结合。只有在特定的 pH 条件下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜于它们相互结合，并发生催化作用，使酶促反应速度达到最大值，这时的 pH 称为酶的最适 pH(optimum pH)。图 3-3 pH 对酶活性的影响抑制剂对反应速度的影响1.抑制剂(inhibitor) 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。抑制剂通常对酶有一定的选择性。一种抑制剂只能引起某一类或某几类酶的抑制。抑制剂虽然可使酶失活，但它并
37、不明显改变酶的结构。也就是说，酶并未变性，去除抑制剂后，酶活性又可恢复。凡是使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，其作用对酶没有选择性，不属于抑制剂。2. 根据抑制剂与酶分子之间作用特点的不同，通常将抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。（1）不可逆抑制作用不可逆抑制作用(irreversible inhibition)的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行结合，一经结合就很难自发解离，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制。其实际效应是降低反应体系中有效酶浓度。抑制强度取决于抑制剂浓度及酶与抑制剂之间的接触时间。按其作用特点，不可逆抑制又有专一性及非专一性之分。专一性不可逆
38、抑制此类抑制剂专一地与酶的活性中心或其必需基团共价结合，从而抑制酶的活性。例如：有机磷杀虫剂能专一地作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而破坏酶的活性中心, 导致酶的活性丧失。有机磷杀虫剂的杀虫机理：当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，胆碱能神经末稍分泌的乙酰胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经过度兴奋，使昆虫失去知觉，人和家畜产生多种严重中毒症状，甚至死亡。酶的活性恢复：有机磷杀虫剂可用含有-CH=NOH 基的肟化物，或羟肟酸 R-CHNOH 衍生物将其从酶分子上取代下来，使酶的活性恢复。上述反应过程见图 3-4。PXRORO+E-OH PORROEHXPORROE+NCH
39、3CHNO E-OHNCH3CHNO+PORR+有 机 磷 化 合 物 羟 基 酶磷 酰 化 酶(失 活 ) 解 磷 定磷 酰 化 酶(失 活 )图 3-4 羟基酶的失活与恢复非专一性不可逆抑制此类抑制剂可与酶分子结构中一类或几类基团共价结合而导致酶失活。它们主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂,可与氨基、羟基、胍基、巯基等反应。例如：烷化巯基的碘代乙酸、某些重金属(Pb 2+、Cu 2+、Hg 2+)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆结合。酶的复活：用二巯基丙醇或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。图 3-5 所示为巯基酶的失活与恢复。ESHSH+ HgESS巯 基 酶 汞 离
40、 子Hg2+ 失 活 的 酶 分 子二 巯 基 丙 醇H2CH2CSHOH+HgESS失 活 的 酶 分 子 ESHSH复 活 的 酶H2CH2CSOHHg+图 3-5 巯基酶的失活与恢复（2）可逆性抑制作用可逆性抑制作用(reversible inhibition)的抑制剂与酶的结合以解离平衡为基础，属非共价结合，用超滤、透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复。即抑制剂与酶的结合是可逆的。这类抑制大致可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合抑制等(画图)重点讲述竞争性抑制和非竞争性抑制。 竞争性抑制作用：此类抑制剂一般与酶的天然底物结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，从而降低酶
41、与底物的结合效率，抑制酶的活性。这种抑制作用称竞争性抑制作用(competitive inhibition)。例如：丙二酸、苹果酸有与琥珀酸相似的结构，它们是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。COH2C2O COHCO琥 珀 酸 脱 氢 酶-2H COH2COCOH2COCOH2CO琥 珀 酸 延 胡 索 酸 丙 二 酸 草 酰 乙 酸 苹 果 酸图 3-6 琥珀酸脱氢酶竞争性抑制剂特征：a.由于抑制剂与酶的结合是可逆的，抑制强度的大小取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例。b.通过增加底物浓度可降低或消除抑制剂对酶的抑制作用。竞争性抑制在实际生活中的应用：竞争性抑制作用的原理可
42、用来阐明某些药物的作用原理和指导新药合成。磺胺类药物是典型的例子。许多抗癌药物，如氨甲蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶(5-FU)等，几乎都是酶的竞争性抑制剂，它们分别抑制四氢叶酸、脱氧嘧啶核苷酸及嘌呤核苷酸的合成，从而抑制肿瘤的生长。 非竞争性抑制作用 有些抑制剂可与酶活性中心以外的必需基团结合，但不影响酶与底物的结合, 酶与底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合，但形成的酶-底物-抑制剂复合物(ESI)不能进一步释放出产物，致使酶活性丧失。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用(non-competitive inhibition)。激活剂对酶促反应速度的影响（1）激活剂(activator) 凡能使酶
43、由无活性变为有活性或使酶活性提高的物质，通称为激活剂。（2）激活剂(activator)种类 大部分是无机离子或简单的有机小分子。 如 Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂； Cl -是唾液淀粉酶最强的激活剂。 一些小分子有机物，如抗坏血酸、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等，对某些巯基酶具有激活作用。这是由于这些酶需要其分子中的巯基处于还原状态才具有催化作用。还有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。它是金属螯合剂，能除去重金属离子，从而解除重金属对酶的抑制作用。六：临床生物化学实验方法的选择与评价方法和标准品的分级（一）方法的分级临床生化成
44、分的测定方法很多，根据其准确度与精密度的不同可以分为三级。决定性方法（definitive method）是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，测定结果为“确定值”，与“真值”最接近。由于技术要求太高，费用昂贵，不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于发展及评价参考方法和标准品。参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差很小，与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性、直线性及较宽的分析范围。这类方法应在条件优越的实验室中应经常使用。但它主要应用于鉴定常规方
45、法，评价其误差大小，干扰因素，并决定其是否可以被接受。它也用于鉴定二级标准品，为质控血清定值，也可用于评价商品试剂盒等。常规方法（routine method）常规方法的性能指标符合临床或其它目的需要，有适当的分析范围，而且经济实用。所谓偏差已知的方法是指准确度已经确定的方法，其准确度不明者称为偏差未知的方法。常规方法在作出评价以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。临床化学方法之间关系可见图 20-2。图 20-2 临床化学方法的关系图（二）标准品的分级国际标准化委员会将标准品（参考物）的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质，并将其
46、分成三级。一级标准品一级标准品（原级参考物）是已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量。它可用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（NBS）发给合格证书，并指明它的性质和有关数据。二级标准品二级标准品（次级标准品）或是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），或存在于相似基质中。这类标准品可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值。控制物控制物有冻干的或溶液，可以用适当的标准品（一级或二级）以参考方法定值
47、，用于质量控制，不用于标化（除经准确定值者）。评价实验与分析误差类型的关系方法学评价(evalution of methodology)的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，不伦精密度还是准确度，强调 的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。因此，方法评价的各项实验是配合检测各种类型的分析误差而设计的，表 20-1 表示了它们之间的关系。 表 20-1 评价实验与分析误差类型的关系分析误差的类型 评价实验初步试验 最后试验偶然误差 批内(或天内)重复性 天间重复性恒定误差 干扰 与比较方法对比比例误差 回收 与比较方法对比二、实验方法
48、的评价（一）重复性试验目的在于考察候选方法的随机误差，重复性试验的方法是对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。（二）回收试验所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。 方法将被分析的纯品标准液加入病人样品中，成为分析样品，原病人样品加入相同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。 回收率计算：以测定血清钙为例说明如下： 样品制备1) 基础样品：血清 2ml蒸馏水 0.1ml；2) 分析样品：血清 2ml4mmol/L 钙标准液 0.1ml；3) 分析样品：血清 2ml25mmol/
49、L 钙标准液 0.1ml； 计算公式及计算结果故本例的管的加入量分别为： 回收浓度分析样品测得浓度基础样品测得浓度回收率()回收浓度/加入浓度100本例结果见表 20-2表 20-2 血清钙回收试验结果 测得浓度(mmol/L) 加入浓度(mmol/L) 回收浓度(mmol/L) 回收率1.70 1.88 0.19 0.18 94.72.85 1.19 1.15 96.6平均 95.7理想的结果期望回收率达到 100，现在平均回收率为 95.7，有 4.3的比例误差，它表明一个含钙真值为 2.5mmol/L 的标本，若用该方法测定，约为 2.39mmol/L(2.595.79)，误差为 0.11mmol/L(2.54.3)。（三）干扰试验 干扰试验的目的也是用来衡量候选方法的准确度的。在加入一定浓度的干扰物的条件下， 形成的是恒定系统误差。干扰
