1、Acme HPLC,HPLC Basic,目录,HPLC 基本理论溶剂传输系统 (泵)进样器色谱柱检测器流动相,什么是色谱图?,样品与流动相、固定相之间的吸收、分配、离子交换、体积排阻等作用，将混合组分分离成各个独立的组分。 分离、定性、定量：分析色谱 分离、纯化：制备色谱Injection（进样） Interaction（相互作用） Elution（洗脱） abacbc aabcbc a b c,色谱方法的发展历程,色谱分析,HPLC 系统的配置,溶剂传输系统 (泵),泵,将溶剂（流动相）从溶剂瓶传送到进样器泵 - 流速和压力的稳定性 - 操作方便, 可用于多种不同的溶剂 - 防止脉冲的系统
2、 - 可用于等梯度模式和梯度模式- 持久耐用,流路图,泵操作模式,等梯度模式 - 分析过程中，溶剂组分保持不变梯度模式 - 分析过程中，按时间改变溶剂组分- 单泵 : 低压梯度模式- 并联泵 : 高压梯度模式,等梯度模式,最基本的配置在分析过程中，泵有效地传输组分不变的溶剂,梯度模式,按时间改变溶剂组分单泵 : 氦脱气和真空脱气,2) 并联泵,操作泵的注意点,1. 必须对溶剂进行脱气 2. 勿空转3. 使用缓冲溶液之后一定要用水清洗 4. 检查溶剂间的可混合性5. 启动泵之前要灌泵6. 控制脉冲7. 检查泵压,进样阀,进样阀,流动相中加载样品，使流动相把样品带入色谱柱进样阀- Rheodyne
3、 进样阀 (手动进样阀)- 自动进样器,使用进样阀的注意点,1. 使用进样针前要清洗干净，并去除气泡 2. 清洗进样针 : 选择样品易于溶解的溶剂3. 附加清洗方法 : 使用过的溶剂 丙酮 二氯甲烷4. 使用自动进样器针管清洗溶液时要格外注意5. 连接管线越短越好 (进样阀和色谱柱, 色谱柱和检测器)6. 管线的错误连接会导致死体积的发生,Rheodyne 进样阀,1. 定量环进样阀 进样量由定量环体积决定2. 需要定期清洗定量环,进样方式,1. 全充满- 进样量是固定时- 进样体积 : 定量环体积的三倍以上- 正确性 : 0.1%2. 部分充满- 进样量是可改变时- 进样体积 : 小于定量环
4、体积的一半- 正确性: 1% (取决于进样技术),自动进样器,1. 自由进样 改善了实验室的生产力 2. 极好的重现性 3. 自动化 温度控制, 预处理Young Lin HPLC 系统- Spark-Holland 产品 Basic Marathon 自动进样器 Triathlon 自动进样器 Midas 自动进样器,自动进样器类型,Spark-Holland 自动进样器,色谱柱,什么是色谱柱 ?,色谱柱把混合物分离成各个单个成分色谱柱的选择- 填料- 粒径- 硅胶形状- 孔径,填料性质,粒径大小,填料的粒径越小 分离度 增加 背压 增加,硅胶形状,不规则形,球形,孔径大小,孔径大小 : n
5、m or 选择孔径大小的方法,填料特性,孔径大小 & 分配 : - 孔径小 = 柱效高 = 减小谱带展宽现象球形或不规则形 : - 不规则形= 表面积大 = 碳载量高- 球形 = 柱压低 = 寿命长- 球形= 很好的结构稳定性 = 寿命长 微粒大小- 微粒小 = 所能承受的操作压力高 = 柱效高,色谱柱,材料- Steel 色谱柱- PEEK 色谱柱分离原理- 正相色谱柱- 反相色谱柱- 离子交换色谱柱- 体积排阻色谱柱,色谱柱材料,Steel 色谱柱 : 钢卡套柱 柱接头 PEEK色谱柱Radial-Pak 色谱柱,分离方法,正相分离反相分离离子交换体积排阻,1. 正相 (吸附),官能团的极
6、性 使用疏水性、非极性的溶剂 极性大的化合物后流出,正相色谱柱,Silica phase（硅胶柱）- Resolve silica, u-Porasil, Nova-Pak silica - Hypersil silica, Nucleosil silica, Zorbax silica键合固定相- Nova-Pak CN, NH2 - u-Bondapak CN, NH2 - Resolve CN, NH2 - Hypersil CPS, APS - Lichrosorb CN, NH2, Diol - Zorbax CN, NH2,2. 反相分离 (分配原理),键合固定相（C18，C8，C
7、N，ph）与被分析物之间的分配作用，达到分离待测物的目的使用极性溶剂 非极性的化合物后流出,反相色谱柱,- u-Bondapak C18, CN, Phenyl - Resolve C8, C18, CN, Phenyl - Lichrosorb RP-18, RP-8 - Delta-pak C18, C8 - Symmetry C18, C8 - Symmetryshield RP8 - Hypersil ODS, Phenyl CPS - Zorbax ODS, C8, CN, Phenyl N, Phenyl,C18 色谱柱,封端技术,-Si-O-Si-(CH3)3,正相和反相对比表,
8、3. 离子交换,分离原理：各离子所具有的不同的电荷吸引力,色谱柱填料,离子交换色谱柱,IC-pak Anion/Cation SAX(Strong Anion Exchanger)/SCXProtein-pak DEAE/SP HR,4. 体积排阻,体积排阻色谱柱,GPC : Styragel HR, HT, HMW Series Aqueous GPC : Ultrahydrogel Series(凝胶渗透)Aqueous GFC : Protein-pak Series(凝胶过滤),色谱柱的选择,正己烷,Y,Silica, Porasil,N,甲醇,Y,CN, Ph, C8, C18,TH
9、F,N,GPC:Styragel HR, HT, HMW,Y,离子性,N,Y,NR3, COO, SO3,M.W., 2000, 2000,有机溶液,Y,水,GPC:Ultrahydrogel Protein-pak,N,Y,保留时间,容量因子,VR = 保留体积 V0 = 死体积 t R = 保留时间 t 0 = 死时间 tR = 相对保留时间,选择性,柱效,分离度,分离度,色谱柱保存方法,色谱柱 : 用不与填料反应的溶剂填满,1) 正相色谱柱 : 正己烷2) 反相色谱柱 : 清洗之后用60-70% 有机溶剂(CH3CN, MeOH)填满长期保管 : 100% MeOH, CH3CN,3)
10、离子交换色谱柱- 无机阴、阳离子色谱柱长期保管: 10% CH3CN短期保管: 流动相 or 5% CH3CN * IC-pak 阳离子色谱柱 : 2mM HNO3- 有机阳离子色谱柱 长期保管: 10% EtOH短期保管: 水，在 4- 有机阴离子色谱柱 : 水，在4,4) 体积排阻色谱柱GPC色谱柱 : 指定的溶剂 Aqueous GPC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水或 20% 有机溶剂 Aqueous GFC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水或 20% 有机溶剂,色谱柱的清洗,1. 正相色谱柱(柱容量的10倍) 甲醇-甲吡酮 氯化物-庚烷(异辛烷)2. 反相色谱柱 (柱容量的
11、10倍) 水-甲醇-氯仿-甲醇-水3. 离子交换色谱柱阳离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH-水-30% 乙酸 (or 0.1N HNO3 ) 水阴离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH(12ml)-水-30% 乙酸 (12ml)4. 体积排阻色谱柱 流动相,检测器,检测器,输出比例于样品量的电子信号要求1. 信噪比 : 高 2. 噪音、漂移 :小 3. 检测限 : 小 4. 稳定的流速、温度、压力 5. 梯度分析6. 选择性,检测限/定量限,检测限 : S/N = 2 或 3 定量限 : S/N = 大约 10,检测器,光学检测器1. 紫外/可见光检测器2. 荧光检测器3. 示差检测器4.
12、 蒸发光散射检测器（ELSD）电化学检测器1. 电导检测器2. 电化学检测器,检测器的特征,对温度的 敏感度,RI,UV/VIS,荧光,电化学,电导,响应,选择性,对流速的 敏感度,u,s,s,s,s,ug,ng,pg,pg,ng,YES,NO,NO,YES,YES,YES,YES,YES,NO,NO,u : 通用性, s : 选择性,ELSD,u,NO,紫外/可见光吸收检测器,光源中的特殊波长通过流动池，一部分被吸收、另一部分通过样品。 特定样品对特定波长的吸光度高。 被吸收的光能比例于样品浓度A = bc ( Lambert- Beers Law )A : 吸光度 : 摩尔吸光系数 b :
13、 光程长 C : 样品的浓度,紫外/可见光吸收检测器,1) 固定形- 按光源可使用几个固定的波长- 波长: 214,229,254,265,280,313,340,405,436,546nm2) 可变形- 在波长190-900nm范围中选择,3) 光电二极管阵列检测器- 同时扫描190-800nm之间的波长,常用溶剂透过波长下限,利用PDA检测器的药物分析,荧光检测器的光路图,用FLD分析PAH,示差折光检测器,原理- 测定根据样品浓度变化而改变的折射率之差- 流动池 : 样品池、参品池 - 参品池是以流动相填满 分析期间流动相只流过样品池应用范围- 聚合物, 糖 - 用于分析以紫外检测器和荧
14、光检测器无法检测的样品,Structure of RI Detector,应用于凝胶渗透色谱系统,测定高分子物质的分子量- 用标样画出校正曲线，用R.T决定未知样品的分子量分析条件- 检测器 : RI 检测器,GPC色谱图,使用 RI检测器分析糖,电化学检测器,ELSD 检测器 ZAM 3000,ELSD 检测器 ZAM 3000 是高灵敏的通用检测器ELSD检测用紫外检测器、示差检测器无法检测器的物质，可检测任何不挥发性物质，而且还可用于梯度洗脱。,ZAM 3000,工作原理,雾化器,样品溶液（流出液）被特殊制作的玻璃雾化器雾化。,样品处理,样品被雾化之后，一部分蒸发带到检测器，大部分被凝成
15、小滴掉下排出。 雾化器和蒸发管的材质是玻璃，因此不易被化学侵蚀，而且易于清洗。,检测器的气体流速,喷雾气体在蒸发管内被与辅助气体和混合。 检测器位于蒸发管上端,检测池结构,LED光源长时间提供稳定光能。,分析磷脂,组分: Phosphatidyl choline / Lysophosphatidyl choline色谱柱: Merck Lichrospher 100diol-5 125 x 4 mm 色谱柱温度: 40 C溶剂: 梯度洗脱 A: n-正己烷 / 2-Propanol / 乙酸/ 三乙胺 B: 水 / 2-Propanol / 乙酸/ 三乙胺 ELSD-Detection: 气体
16、 压力 (喷雾气体): 1,0 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,7 L/min 温度: 50 C,http:/www.schambeck-,分析糖,组分: Xylose / Glucose / Saccharose / Lactose色谱柱: HyperSil APS, 5, 250 x 4.6 mm 色谱柱温度: ambient溶剂: 乙腈:水 90:10, 流速: 1,0 mL/min ELSD-检测: 气体 压力 (喷雾气体): 1,6 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min 温度: 50 C,分析有机酸溶液,组分: Malic acid / Succinic a
17、cis / Fumaric acid色谱柱: Inertsil ODS-3, 5 m, 250 x 4,6 mm 色谱柱温度: ambient溶剂: 0,01% Trifluoro 乙酸(TFA) in 90/10 甲醇/水. ELSD-Detection: 气体 压力 (喷雾气体): 1,6 bar 气体 流速 (辅助气体)： 1,5 L/min 温度: 50 C,分析聚苯乙烯标样混合剂,组分: Polystyrene mix 18700 / 8300 / 2360色谱柱: Jordi Gel DVB, 500 , 500 x 10 mm 色谱柱温度: ambient溶剂: THF, 流速
18、1 mL/min. ELSD-Detection: 气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,1 L/min 温度: 35 C,分析聚乙二醇,组分: Polyethylene Glycol色谱柱: OptoSil ODS-2, 5 m, 300 x 4 mm 色谱柱温度: ambient溶剂: 梯度洗脱 A: 水/甲醇 80/20 B: 水/甲醇 50/50 流速 : 1mL/min ELSD-Detection: 气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min 温度: 50 C,分析高级醇,组分: Higher A
19、lcohols色谱柱: Inertsil ODS-3, 40 x 4 mm溶剂: 水/乙腈 5/95ELSD-Detection: 气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min 温度: 50 C,检测尿素,组分: Urea 5mg/100 mL in 80/20 乙腈 / 水色谱柱:溶剂: 80/20 乙腈 / 水 ELSD-Detection: 气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar 气体 流速 (辅助气体): 1,1 L/min 温度: 25 C,用ECD检测儿茶酚胺,电导检测器,用电导检测器分析阴离子,色谱 数据工作站,控制器数据处理网络
20、工作,工作站的发展历程,溶剂,溶剂的条件,流动相- HPLC 等级(水 : 18.2兆欧) - 粘度低- 溶剂的可混合性 (混合性值差 : 小于15 )- 不可以改变固定相- 溶解性 - 透过波长下限, 折射率 : 低,溶剂的可溶性,流动相的混合,过滤- 水性过滤膜(PVDF) : 用水活化- 有机过滤膜(PTFE) : 用甲醇活化脱气- 去除空气、氧气、气泡 - 真空脱气 : 过滤+ 脱气- 氦脱气 : 把氦气灌入溶剂中- 超声波处理,使用缓冲液,1) 离子化合物 : 抑制离子2) 生理学样品 : 调节PH3) 分离成离子对 : 调节离子浓度,抑制离子,- 色谱柱: Metachem Polaris C18-A 5um,1504.6mmEluent: ACN:20mM KH2PO4=10:90 (用乙酸调节pH 3.3 ) - 检测: UV 225nm - 流速: 1.4 ml/min,离子对,- 色谱柱: Metachem Polaris C18-A 5um,1504.6mm 洗脱液: ACN:20mM KH2PO4=10:90 (用 乙酸调节pH 3.3 ) - 检测: UV 225nm - 流速: 1.4 ml/min,
