1、1高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的含量Determine the melamine contents in milk powder by HPLC【摘 要】 三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。乳制品中添加三聚 氰胺会使得食品的蛋白 质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。就送 检的奶粉 样品，采用高效液相色 谱法（HPLC）测定其中三聚氰胺的含量。AbstractThe melamine is one kind of low-toxin industrial chemicals. Animal experiment
2、s show that its metabolism in animals is quick and would not persist. Adding melamine in dairy products will cause the result of protein contents testing to be higher,by which those inferior goods can pass tests operated by Food Inspection Service.This thesis is about a determination of melamine con
3、tents by HPLC in milk power samples.【关键词】 三聚氰胺 食品质量与安全 奶粉 标准依据 高效液相色谱 检测方法Key words: melamine Food Quality and Safety milk criterion HPLC test method1.设计思想及相关标准进入新世纪以来，我国的奶业发展连年创造辉煌，无论是奶牛存栏头数还是总产奶量都在以惊人的速度增长。在 2000 年至 2007 年期间，全国的奶牛存栏量增长了 1.5 倍，牛奶产量增长了 3.3 倍。然而，当时间的指针指向 2008 年 9 月 11 日的那一刻，也就是从三鹿集团正
4、是向社会承认三聚氰胺问题奶粉的那一刻起，使一个原本健康的朝阳产业转瞬间成为一个“病危患者” ，业界多年创造的辉煌已成为历史。“三聚氰胺奶粉”事件被有关媒体披露后，全社会为之震动，有人称之为“奶业地震”，更有甚者称之为食品行业的“9. 11”。1.1 三聚氰胺三聚氰胺（英文名 Melamine） ，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，又叫 2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5- 三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，密度 1.573gcm3 (16)。常压熔点354（分解
5、） ；快速加热升华，升华温度 300。溶于热水，水溶性 3 G/L (20 C)，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。低毒。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物，分解时同时放出不支持燃烧的氮气，因此可作阻燃剂。三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰2胺甲醛树脂（MF）的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药
6、等行业。1.1.1 三聚氰胺的毒性目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于 3 克/公斤体重。据 1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994 年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的国际化学品安全手册第三卷和国际化学品安全卡片也只说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。1.1.2 人体对三聚氰胺耐受标准三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。三聚氰胺量
7、剂和临床疾病之间存在明显的量效关系。三聚氰胺在婴儿 体内最大耐受量为每公斤奶粉 15 毫克。专家对受污染婴幼儿配方奶粉进行的风险评估显示，以体重 7 公斤的婴儿为例，假设每日摄入奶粉 150 克，其安全预值即最大耐受量为 15 毫克/公斤奶粉。根据美国食物及药物管理局的标准，三聚氰胺每日可容忍摄入量为每日 0.63 毫克/公斤体重。1.1.3 三聚氰胺为何用于掺假蛋白质主要由氨基酸组成。在当前的食品检测当中，蛋白质的检测通常是测出食品中的含氮量，推算其中的蛋白质含量。这种测定蛋白质含量的方法称为“凯氏定氮法” 。蛋白质平均含氮量为 16左右，而三聚氰胺的含氮量为 66左右。因此，添加三聚氰胺会
8、使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。据估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现。加之目前我国食品和饲料当中蛋白质含量检测最主要办法即为来自上述的“凯氏定氮法”，此法只能测出含氮量，并不能区别饲料中有无合规添加剂或违规化学物质，由此，价廉且容易获得的三聚氰胺便可以堂而皇之地代替了真正的蛋白质而混入婴幼儿食用的配方奶粉之中。然而，三聚氢胺本身几乎没有任何营养价值，并不能真正替代蛋白质，添加之后，只能造成蛋白质含量提高的假象，奶粉当中的营养物
9、质含量必然大大低于正常值。利用食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人称为“蛋白精” 。1.1.4 相关致病案例32007 年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明：掺杂了6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008 年 9 月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。2008 年 9 月 26 日报道：上海光明食品集团 26 日决定，光明食品集团下属冠生园公司生产的大白兔奶糖，个别国家、地区从上海冠生园食品有限公司
10、出口的“大白兔”奶糖中检出三聚氰胺，海外被检出三聚氰胺的部分奶糖正抓紧实施下架、召回等措施。国家质检总局紧急在全国开展了婴幼儿奶粉三聚氰胺含量专项检查。此次专项检查对其余 109 家企业进行了排查，共检验了这些企业的 491 批次产品。阶段性检查结果显示，有 22 家婴幼儿奶粉生产企业的 69 批次产品检出了含量不同的三聚氰胺。1.2 相关标准及检测方法针对以上事实及造成的危害，国家有关部门卫生部、质检总局、农业部、工商总局等及时作出应对措施，由中国检验检疫科学院、中国疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、国家乳制品质量监督检验中心等单位起草并通过对原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺
11、含量的检测发布国家标准 GB/T 22388-2008。本标准规定了原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的检测方法，即高效液相色谱法（HPLC） 、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱联用法包括气相色谱-质谱法（GC-MS） ，气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS） 。三者均适用于原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。其中，后两者还同时适用于原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺定性确证。其定量限分别为高效液相色谱法（HPLC）2mg/kg，液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）0.01mg/kg, 气相色谱-质谱法（GC-MS）0.05mg/kg，气相色谱-质谱/质
12、谱法（GC-MS/MS）0.05mg/kg。就送检的奶粉样品，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其中三聚氰胺的含量，其具体过程如下：2.实验目的及实验原理2.1 实验目的测定奶粉样品中三聚氰胺的含量。2.2 实验原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。3.设计实验的具体操作步骤3.1 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。3.1.1 甲醇：色谱纯。3.1.2 乙腈：色谱纯。43.1.3 氨水：含量为 25%28%。3.1.4 三氯乙酸。3.1.5 柠檬酸。3.1.6 庚烷磺酸钠：色谱纯。3.1
13、.7 甲醇水溶液：准确量取 50mL 甲醇和 50mL 水，混匀后备用。3.1.8 三氯乙酸水溶液（1%）：准确称取 10g 三氯乙酸于 1L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。3.1.9 氨化甲醇溶液（5%）：准确量取 5mL 氨水和 95mL 甲醇，混匀后备用。3.1.10 离子对试剂缓冲液：准确称取 2.10g 柠檬酸和 2.16g 庚烷磺酸钠，加入约 980mL 水溶解，调节 PH 至 3.0 后，定容至 1L 备用。3.1.11 三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于 99.0%。3.1.12 三聚氰胺标准储备液：准确称取 100mg（精确到 0.1mg）三聚
14、氰胺标准品于 100mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/mL 的标准储备液，于 4避光保存。3.1.13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL。使用前用 3mL 甲醇、5mL 水活化。3.1.14 定性滤纸。3.1.15 微孔滤膜：0.2m，有机相。3.1.16 氮气：纯度99.999%。3.2 仪器和设备3.2.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。3.2.2 分析天平：感量为 0.0001g 和 0.01g。3.2.3 离心机：转速不低于 400
15、0 r/min。3.2.4 超声波水浴。3.2.5 固相萃取装置。3.2.6 氮气吹干仪。3.2.7 涡旋混合器。3.2.8 具塞塑料离心管：50mL。3.3 样品处理3.3.1 提取称取 2g（精确至 0.01g）试样于 50mL 具塞塑料离心管中，加入 15mL 三氯乙酸溶液（3.1.8）和 5mL 乙腈，超声提取 10min 后，以不低于 4000 r/min 转速离心 10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至 25mL，移取 5mL，加入 5mL水混匀后做待净化液。3.3.2 净化5用 3mL 甲醇，5mL 水淋洗固相萃取柱（3.1.13） ，将 3.3.
16、1 中的待净化液转移至萃取柱中。依次用 3mL 水和 3mL 甲醇洗涤，抽至近干后，用 6mL 氨化甲醇溶液（3.1.9）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1mL/min。洗脱液于 50下用氮气（3.1.16）吹干，残留物（相当于 0.4g 样品）用 1mL 流动相定容，涡旋混合 1min，过微孔滤膜（3.1.15）后，用HPLC 仪测定。3.4 高效液相色谱测定3.4.1 HPLC 条件 仪器型号：Alliance 2695 。 环境条件： 温度：22 。 相对湿度：38%RH 。 色谱柱：C 18 ，250mm4.6mm（i.d.） ，5m。 流动相：离子对试剂缓冲液（3.1.10）-乙腈
17、（90+10，体积比） ，混匀。 流速：1.0mL/min。 柱温：40 。 波长：240nm。 检测器：PDA。 进样量：10L。3.4.2 标准曲线的绘制参照 GB/T 22388-2008，用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2.0、20.0、40.0、80.0g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 HPLC 色谱图参见下图3.4.3 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再6进样分析。3.4.4 结果计算按下表中的数据记录、公式进行计算液相色谱测定三
18、聚氰胺数据记录检测日期 2009-04-09 方法依据 GB/T22388-2008环境温度 22 相对湿度 38%RH仪器型号 Alliance2695 流动相 离子对缓冲液+乙腈=90+10色谱柱 C18 流速（mL/min） 1.0检测器 PDA 波长（nm） 240方差允许 相对偏差10% 公式 X= PstiVmSTC1重复次数 浓度 C1 进样体积 VST 保留时间 RT 峰面积 Psti 峰面积平均值1 10.00 10.00 11.702 303297标准溶液2 10.00 10.00 11.703 302837 303067样品名称重复次数样品质量m(g)稀释体积V(mL)进
19、样量V1(L)保留时间峰面积P1含量X(mg/kg)平均值(mg/kg)实测误差1 2.00 22.05-1 10.00 11.671 95283 6.92奶粉2 2.00 22.05-1 10.00 11.666 94791 6.886.90 0.3/备注 最低检出限为 2mg/kg，标准图谱见 GB/T22388-2008 附图 A7两次进样的 HPLC 记录显示结果图第一次进样第二次进样83.5 空白实验不称取样品，按上述测定条件和步骤进行实验。3.6 三聚氰胺在乳及乳制品中的限量值3.6.1 婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 1mg/kg。3.6.2 液态奶（包括原料乳） 、奶粉及其
20、他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 2.5mg/kg。3.6.3 含乳 15% 以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为 2.5mg/kg。本方法的定量限为 2mg/kg。3.7 回收率在添加浓度 2mg/kg10mg/kg 浓度范围内，回收率在 80%110%之间，相对标准偏差小于 10%。3.8 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。4.实验结果及判定4.1 实验结果在符合要求的条件及规范的操作步骤的前提下，经检验该样品的三聚氰胺含量为6.90mg/kg。4.2 结果判定根据 GB/T 22388-2008 规定，该样品三聚氰胺含量 6.90mg/kg，大
21、于规定的 2mg/kg，9产品不合格。5.结语检测是手段，乳制品的质量安全才是最终的目的。一旦发生食品质量安全事故，首先受到伤害的是消费者。在受到伤害的情况下，消费者对食品质量安全事故做出的第一反应就是拒绝继续消费问题产品。于是就造成了一系列的食品质量安全“伤害效应”，表现为对消费者产生的伤害效应、对加工企业和奶站产生的伤害效应和对广大奶农产生了伤害效应。“三聚氰胺奶粉”事件发生后，由于一些西方媒体的渲染，引起了部分国外消费者对中国食品的恐慌。然而，要恢复我国食品行业在国际上的地位和影响，需要漫长的时间和更加艰辛的努力。总体上看，我国奶业在农业中依然是一个发展相对滞后的产业，牛奶的人均占有量和
22、消费量都显著低于世界平均水平，与发达国家的差距更大。要缩小我国奶业与世界及发达国家的差距，今后的道路还很漫长，任务还相当艰巨，需要以科学发展观为指导，把我国奶业引向健康发展之路。当前我国奶业所面临的体制、机制以及技术层面的问题有许多，需要长期努力逐步加以解决。从长远发展战略的高度出发，对今后如何提高我国奶业的质量安全水平提出三点建议：1.转变食品质量安全监管模式，2.改进产业化经营模式，3.走以家庭农场为主的规模化之路。相信在这些标准条例、监督管理的不断完善下，我国的乳制品行业会越来越规范，安全。附：家庭检测奶制品中是否含有三聚氰胺的简便方法。1.按比平常浓的分量用热水冲奶粉，充分搅拌到不见固
23、块，然后放入冰箱，待牛奶静置降温。2.准备黑布一块和空杯一个。把黑布蒙在空杯口上作为过滤器。3.将冷却的牛奶倒在黑布上过滤。4.如果有白色固体滤出，则用清水冲洗几次，排除其它可溶物。5.如果冲洗后发现有白色晶体，可以将晶体放入清水中，该晶体如果沉入水底。那就很可能是三聚氰胺，这种奶粉不能用了。参考文献：1GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法。2GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3李胜利，杨敦启，曹志军等.如何整顿我国乳制品行业三鹿奶粉事件反思.中国畜牧杂志.2008 年第 18 期。4刘玉满.后“三聚氰胺”时代呼唤我国奶业要走科学发展之路.中国奶牛.2008 年第 13 期。 5从三鹿奶粉事件认识三聚氰胺.资源与人居环境.2008 年第 9 期。6李永庆，王军.三聚氰胺的生产与应用.化工科技市场.2004 年第 5 期。7林祥海，王建峰，贾广乐等.三聚氰胺的毒性研究.毒理学杂志.2008 年第 22 期。
