1、3 大规模植物细胞培养生产药用成分植物细胞的大量培养是利用植物细胞体系,通过现代生物工程手段进行工业规模生产,以获得各种产品的一门新兴的跨学科技术。首次提出从植物细胞培养物中合成天然药物的是1956年美国的Routier 和Nickell ,1967 年Kaul 和Staba采用多升发酵罐对小阿米( Ammi visnaga) 进行了细胞大量培养的研究,并首次用此方法得到了药用成分呋喃色酮(Visnagin) 。七八十年代,植物组织培养、植物原生质体培养等各种植物培养技术与植物细胞培养技术共同发展,在培养基配方、环境条件控制、悬浮培养技术等研究方面相互借鉴、相互促进1 ;而大规模培养技术方面,
2、得益于微生物发酵技术的飞速发展,各种各样的反应器如气升式、气泡柱式、模式等反应器相继得到应用,使得植物细胞大量培养的研究迅速得到借鉴发展。这些年来植物细胞培养技术主要致力于高产细胞株选育方法、悬浮培养技术、多级培养和固定化细胞技术、培养工艺优化控制、生物反应器研制、下游纯化技术等方面的研究,并取得了较大进展2 。近几年有些技术用于植物细胞培养对提高产物含量,降低成本有一定的作用。这些技术有: (1) 发状根培养技术和冠瘿组织细胞培养技术。发状根(Hairy root ) 和冠瘿组织(Crown galltissue) 在离体培养时都具有激素自主、增殖较常规细胞培养快、次生代谢物含量一般比悬浮培
3、养细胞高、且能合成某些悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物以及能引入外源基因表达等特点,从而引起人们利用它们生产药用次生代谢物的重视。如利用桔味薄荷( Mentha citrata) 冠瘿细胞生产萜烯,洋地黄( Digitalis) 冠瘿细胞生产强心甙,丹参冠瘿细胞生产丹参酮3 ,长春花冠瘿细胞生产吲哚生物碱4 ,人参发状根培养生产人参皂甙,长春花发状根培养生产长春碱,青蒿发状根培养生产青蒿素5 ,萝芙木发状根培养生产生物碱6 等等。(2) 两相培养技术7 。两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物,或者是具有吸附作用的多聚化合物(如大孔树脂等) ,使培养体系形成上、下两相,细胞在水相
4、中生长与合成次生物质,然后分泌出来转移到有机相中。这样不仅减少了产物的反馈抑制作用,使产物含量提高,而且通过有机相的不断回收及循环使用,有可能实现植物细胞的连续培养,使成本降低。不少植物培养细胞已成功地建立了两相培养系统,如Payne 等在培养的长春花细胞中加入XAD - 7 大孔吸附树脂,可以使吲哚生物碱的含量提高;在培养的花菱草悬浮细胞中加入一种液体硅胶,可使血根碱的含量大大提高。大规模植物细胞培养技术经过几十年的努力研究,已取得很大的进展,有些药用植物种类已实现工业化生产,如从希腊毛地黄( Digitalislanata) 细胞培养物通过生物转化生产地高辛(Digoxin) 、从日本黄连
5、( Coptis japonica) 细胞培养物中生产黄连碱(Coptisine) 、从人参根细胞中生产人参皂甙等;相当种类的药用植物细胞大量培养已达到中试水平,如长春花生产吲哚生物碱、丹参生产丹参酮、青蒿生产青蒿素、红豆杉生产紫杉醇、紫草生产萘醌、三七生产皂甙等等。目前大多数植物细胞大规模培养生产药物距商业化生产还有一定差距,主要是由于: (1) 植物细胞的生长周期长,易污染。(2) 植物细胞对生物反应器的设计装置要求较高。(3) 高产细胞株较难获得8 。目前据报道只有20 多种植物的细胞培养物,其次生产物含量超过原植物,原因被认为是培养细胞的形态分化受到抑制,而大多数次生产物要在分化了的细
6、胞中产生。由于以上的问题,加上与之相比,直接提取法成本很低,所以在很大程度上限制了大规模植物细胞培养技术生产药物走上商业化生产的步伐。但是,对一些不易栽培、稀少、不能或难以化学合成、有很高应用价值的药物,如紫杉醇,用这种方法开展研究进行生产还是很有商业价值的,而且从长远和环境保护的角度看,它应该有非常广阔的商业前景。4 转基因植物生产药物最近十几年来,植物基因工程取得了相当大的进展。用大肠杆菌、酵母等微生物发酵生产药用蛋白虽早已进入商品化生产的阶段,但仍有一些问题尚未得到很好解决。随着植物基因工程技术的发展和成熟,科学工作者们希望把药用蛋白的生产从微生物转向植物,因为其有以下优点: (1) 植
7、物是真核生物,可在自身细胞内完成蛋白质的糖基化等后加工过程,使生产的药物更有利于人体吸收。(2) 微生物在生长过程中会产生毒蛋白等有害的副产品,如纯化工艺不过关,将会给服用药物者带来危险;而植物对人类无毒,许多植物可以食用,所以人们对植物药物较易接受。还可制成口服剂型,简化下游纯化工艺。这方面的工作,最早是1988 年比利时PGS 公司将一个神经肽(enkephelin ,五肽) 的编码基因转入烟草中表达成功,得到产量高达200 nmol/ 种子的五肽神经肽9 ,10 。近几年来还有不少这类成果,如:美国利用植物基因工程技术生产白细胞介素2 ,荷兰用转基因马铃薯生产人的血清白蛋白,南朝鲜用转基
8、因烟草和番茄来生产人的胰岛素等等11 。科学工作者们已成功地对多种植物进行了转基因的工作,使之生产药用蛋白,这些植物有: 玉米、大豆、苜蓿、向日葵、烟草以及油菜1215 。最近,免疫学与植物基因工程相结合的学科间研究,产生了一种新的疫苗生产方式,即口服疫苗。口服疫苗解决了常规大规模疫苗生产中常用的细胞培养系统有关的许多问题,包括发酵技术、严格的纯化和冷冻贮存、运输,免除了使用活病原体带来的风险和注射疫苗的灭菌。现Boyce Thompson 研究所的研究人员已成功地在马铃薯中产生可食用的霍乱疫苗;美国正在开发研究可产生治疗人类高歇氏病和费勃莱氏病的酶的烟草16 。现还有一种新思路,以病毒为载体在植物中生产药用蛋白,这种方法是先将目的基因插入病毒基因组中,然后把重组病毒接种到植物叶片上任其蔓延至所有叶片,外源基因则随病毒的复制而得到高水平的表达,这样的植物就成了生产蛋白质的“绿色工厂”17 。目前,这种技术还处在实验阶段。总之,利用植物基因工程方法生产药物还刚刚开始,有很大的发展空间。有科学家估计,植物生物技术的发展将改变半个多世纪以来许多新药单纯依赖化学合成的状况,把人类的医药行业带向一个新的里程碑。
