1、1,高通量药物筛选研究进展 Advance in high throughput screening,杜冠华 Guanhua Du Ph.D.中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所 药物筛选中心 Institute of Material Medica, Chinese Academy of Medical Science &Pekin Union Medical College, Beijing 100050, China.,Prof. Du Guanhua,2,高通量筛选研究进展,高通量药物筛选 高通量药物筛选现状 高通量药物筛选存在的问题 新技术新方法 药物靶点研究 从基因到药物 展望
2、,Prof. Du Guanhua,3,药物研究的基本过程,药 物 发 现 起始阶段，寻找探索临床前研究 制剂、药效、毒理程序化研究 临 床 研 究 临床资料临 床 应 用 应用资料积累,Prof. Du Guanhua,4,高通量筛选与药物发现,药物发现是药物研究的起始 药物筛选是实现药物发现的重要手段 高通量药物筛选是药物发现的早期阶段符合药物发现的规律 是药物发现重要途径,Prof. Du Guanhua,5,新药的类型和发现的特点,Prof. Du Guanhua,6,药物发现的基本规律,Prof. Du Guanhua,7,药物发现的基本特点,Prof. Du Guanhua,8,药
3、物发现的技术概览,生产生活,医疗实践,定向筛选,计算机辅助筛选,高通量筛选,超高通量筛选,药物设计,药物发现,样品制备,组合化学,天然产物,药理研究,生物技术,生物信息,Prof. Du Guanhua,9,药物筛选的基本概念,药物筛选 采用适当的方法，对可能作为药物使用的物质（样品）进行生物活性、药理作用及药用价值的评价过程。,作用评价,筛选方法 （模型）,药用样品,发现药物,Prof. Du Guanhua,10,高通量药物筛选,高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药物活性评价方法（模型），通过自动化手段，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，发现新药的过程。高通量药物筛选的规模至少为每
4、日筛选数千个样品。,Prof. Du Guanhua,11,高通量药物筛选的理论基础,Prof. Du Guanhua,12,高通量药物筛选基本条件 模型,筛选方法(药物筛选模型)基本要求: 微量化；高灵敏度；高特异性；操作简便，能反应药物作用基本类型：分子水平筛选模型：靶点明确，药物作用机理明确，特异性检测 细胞水平筛选模型：机理明确，检测指标特异性高，模型稳定,Prof. Du Guanhua,13,药物靶点及其研究现状,药物靶点的定义所谓药物靶点，简单的定义就是指那些能够与特定药物特异性结合并产生特定作用（主要是指调节生理功能，改变病理过程，缓解疾病症状，治疗疾病等作用）的生物大分子或特
5、定的生物分子结构。在上述定义中有两个重要的前提条件，即药物和药物作用。没有药物存在或没有认识药物作用之前，利用上述定义判断药物靶点就不适用了。因此，发现新的药物靶点需要在理论上和实验方面给予全面的研究和认识。这也是当前许多研究人员面对人类基因组研究的成就盲目乐观的主要原因。,Prof. Du Guanhua,14,药物靶点及其研究现状,药物,药物 靶点,生理调节,解除疾病,药物靶点数据库： http:/ Du Guanhua,15,药物靶点的基本特点,药物靶点 根据目前已经认识的约500种药物靶点进行分析，药物靶点必须具备的生物学特征主要表现在以下方面：a、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可
6、以单独存在或形成聚合体存在； b、具有可以与其他物质（主要是外源性或内源性小分子物质）相结合的部位或位点； c、该物质的结构可以发生变化，而且是在与小分子结合后发生变化，正常情况下，这种变化通常是可逆的；,Prof. Du Guanhua,16,药物靶点的基本特点,药物靶点d、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化； e、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或作用通路中具有主导作用； f、病理条件下该物质的表达、活性、结构或特性可以发生变化，这种变化可以是原发性，也可以是继发性的。 g、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）
7、或外源性配基，其配基的作用已经被认识。,Prof. Du Guanhua,17,药物靶点及其研究现状,药物靶点的分类药物靶点：能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分子结构。候选药物靶点：符合药物靶点的基本特点，但还没有发现特异的药物的生物大分子或生物分子结构。 潜在药物靶点：部分符合候选靶点的条件。,Prof. Du Guanhua,18,药物靶点及其研究现状,以上条件基本上摆脱药物和作用的限制，可以通过对生理条件下的物质信息进行分析，然后判断是否可以确定为药物靶点。但是仍然不能保证符合条件的位点就一定是药物靶点，仍然需要对其进行多方面的研究。对于全部
8、或部分满足以上要求的蛋白质或其他生物大分子，可以作为候选药物靶点进行研究，特别是需要进行生物学的实验研究。 以上药物靶点的基本条件实际上并不能反映药物靶点的生物学特征，通过生物信息学技术和方法，对已知靶点的规律性分析，发现更多新的靶点生物学特征，如结构特征，氨基酸序列特征等，将会有利于促进药物靶点的发现。,Prof. Du Guanhua,19,药物靶点及其研究现状,药物靶点的发现：基因组学研究蛋白质组学研究：生物信息学研究：药物研究：（传统方法）,Prof. Du Guanhua,20,高通量药物筛选基本条件 样品,样品类型： 单一化合物（合成化合物，天然化合物）混合物 （天然提取物，合成化
9、合物）,样品来源： 化学合成、组合化学合成天然产物提取物、组合生物合成、代谢产物,样品保存： 样品库（）温度、湿度、光线 ,样品管理： 数据库管理化合物数据库，提取物数据库,Prof. Du Guanhua,21,样品数据库信息表,Prof. Du Guanhua,22,高通量药物筛选基本条件,自动化操作系统 （实验室自动化工作站）自动操作（加样、稀释、混合、温孵、转移等） 自动检测（时间、顺序、条件等） 数据获得（原始数据、简单处理数据） 结果储存（计算机保存）,Prof. Du Guanhua,23,实验室自动化工作站,自动化工作站,Prof. Du Guanhua,24,Prof. Du
10、 Guanhua,25,高通量药物筛选基本条件 4,检测仪器：分光光度计荧光检测仪放射活性计数仪其他,Prof. Du Guanhua,26,液闪发光计数仪,液闪发光计数仪,Prof. Du Guanhua,27,可见紫外荧光发光分析仪,FluoStar 比色仪,Prof. Du Guanhua,28,高通量药物筛选数据分析,数据分析：数据处理，单位换算，活性结果专业分析：活性强度比较,Prof. Du Guanhua,29,HTS筛选结果分析,Prof. Du Guanhua,30,96,384,864,1536,Prof. Du Guanhua,31,高通量药物筛选成本,Prof. Du
11、Guanhua,32,高通量药物筛选基本程序,模型优化 Assay Optimization,建立模型 Assay Development,活性筛选 Screening,分析技术 Assay Technologies,分析方法微量化 Assay Miniaturization,筛选结果 Profiling,活性化合物 Quality Leads,样品准备Compound Archive,Prof. Du Guanhua,33,药物发现概况,初 筛,复 筛,深入筛选,新药开发 临床前研究 临床研究,活性化合物 Active Compounds,确证筛选,活性样品 Hits,先导化合物 Lead
12、compounds,候选药物 Candidate,Prof. Du Guanhua,34,高通量筛选所面临的挑战,规模扩大： 制药企业为提高工作效率已经投入巨额资金，这种投入成为发展的巨大压力，这种压力意味着药物能够竞争的自由时间很少。通过增加筛选靶点的数量以及对每个筛选靶点进行筛选的化合物数量，成为HTS部门已经响应这种竞争趋势的措施；在不同的制药企业已经制定了面对这些挑战的各种策略。 重要环节： 提高HTS工作效率仍具有巨大潜力，除设备生产、检测方法建立需要不断创新外，将筛选活性化合物的过程与先导化合物的确证等阶段（hit-to-lead steps）密切结合，形成完整的整体，将更有利于相
13、互之间的合作以及全面提高工作效率。,Prof. Du Guanhua,35,药物高通量筛选方法研究进展,Size exclusion chromatography： 通过象共聚焦技术和寿命测定等，适用于快速筛选并产生巨大效益的新的检测技术的高密度板，并已经实现了微量筛选技术。基于亲和力的快速筛选技术。这种技术可将靶点蛋白与化合物的混合物共同孵育后，利用大小排除法色谱技术（size exclusion chromatography）分离化合物，最后通过质谱技术进一步分析化合物的特性。,Prof. Du Guanhua,36,药物高通量筛选方法研究进展,Small focused subsets：
14、根据分子间相互作用力的筛选方法广泛应用，采取的策略也非常灵活，相对集中筛选（small focused subsets），由于具体操作过程易于控制，而且常采用384孔板作为筛选载体，效果更明显。因为激酶靶点的检测试剂的来源问题，适用于激酶检测的芯片实验室的芯片技术（Caliper lab-on-a-chip），以更小的反应体积实现活性筛选，提高筛选速度。,Prof. Du Guanhua,37,药物高通量筛选方法研究进展,滤过和学习的循环：Aventis的滤过和学习的循环策略，能够提高活性化合物的发现率，这种过程包括了来自经过确定的活性结构的新数据库，以此为研究的向导，通过与数据库进行联合应用
15、，经过反复验证和信息反馈，提高化合物中的活性化合物发现率。不过，这种方法并不是对全部的靶点来说都是成功的。,Prof. Du Guanhua,38,药物高通量筛选方法研究进展,IQ检测：近年来研制成功的一种适用于激酶、磷酯酶以及蛋白酶分析的IQ检测平台。这种技术利用溶液中的铁离子化合物与磷酸化的多肽结合时所消失的荧光信号变化，确定药物作用。这种技术也适用于蛋白酶的检测并成功地用于1536孔板。由于这是一种不使用抗体的检测技术，适用于具有广泛范围的荧光颜料、用DMSO溶解的多肽类底物的检测。,Prof. Du Guanhua,39,药物高通量筛选方法研究进展,另一种称为光速(Lightspeed
16、)的检测模式也可以适用于激酶、蛋白酶以及DNA检测。的这种技术可以利用超淬火聚合体监测它们之间的结合信息。这种模式具有不使用抗体、操作步骤少，只需使用自动化操作系统等快速、简便等优点。,Prof. Du Guanhua,40,高通量药物筛选数据处理技术,数据采集：筛选能力的不断提高，筛选方法的多样化，从HTS过程采集的数据也在不断地增加，提高数据质量成为重要研究内容。提高数据质量可以通过提高数据获取技术，如共聚焦技术和高信息读数器等技术；也可以通过降低筛选过程的错误，提高筛选效率，如Genedata的筛选策略（http:/）就特别注意整个筛选过程中每一个检测板上的错误情况。采用剂量-反应模块，
17、可自动阻挡无效数据以及重新绘制已经画出的拟合曲线。 数据处理：对IC50的分析，大多数数据处理工具存在数据利用率的缺陷，而且需要人工操作，消耗大量的时间。Genedata 软件具有绘制趋势能力，能够处理多种数据，获得多种模式数据中的各种最重要信息的功能。通过运算可以列出候补活性化合物目录，并能够完成假阳性结果的删除和假阴性结果的确认。,Prof. Du Guanhua,41,高内涵筛选技术,在高通量筛选的发展过程中，为了减少高通量筛选成本提高筛选速度，采用了缩小筛选样品反应体积的措施，由原来主要在96孔板上筛选实现了384孔板或1536孔板的高密度微孔板筛选。但由于反应体积不可能无限缩小，因此
18、增加每样品单次筛选信息量，发现更多的信息内容，成为新的发展方向，因此逐渐形成了高内涵高通量筛选概念。 在一种筛选模型上同时采集具有不同意义的药物作用信号，这种筛选模型称为高内涵（high contents）药物筛选：能够采集多种信号的高通量药物筛选，则称为高通量高内涵药物筛选。 新概念是为了工作的方便。,Prof. Du Guanhua,42,高内涵筛选技术举例,多细胞因子生成调节药物的筛选 炎症发生过程中有多种细胞如成纤维细胞、巨噬细胞、白细胞等和多种因子参与，特别是IL-1、TNF-、IL-8、IL-6等细胞因子对炎症反应起着重要的调节作用。 实验证明许多抗炎药对这些因子的释放和合成有抑制
19、作用。 建立针对这些因子的体外抗炎药筛选体系，为发现新的具有抗炎作用的药物提供一种快速有效的方法。,Prof. Du Guanhua,43,高内涵筛选技术举例,本实验利用脂多糖体外刺激人血白细胞释放炎性因子的筛选体系人血白细胞5*106/ml+LPS(5ug/ml) 37、5%CO2 孵育 4h 取上清待测IL-1、IL-8、TNF-a,Prof. Du Guanhua,44,高内涵筛选技术,高内涵筛选计数仪，原理是基于一个完全自动荧光显微镜，根据细胞的数目反映单个细胞内的荧光强度和信号位置。作者使用该方法对体外正常人类表皮成纤维细胞增殖进行了量化。作者用胰岛素生长因子、血小板衍生的生长因子、
20、表皮生长因子、成纤维生长因子或血清刺激正常人表皮成纤维细胞后，检测了KI-67抗原的表达、BrdU掺入量、眼癌蛋白磷酸化水平，结果可定量地反映细胞增殖情况。这个方法同时也可采用磷酸组蛋白H3染色法、有丝分裂法、或BrdU掺入法中S相的细胞百分比进行量化测定。使用ArrayScan检测的增殖数据用相关的ELISA和流式细胞仪验证结果可靠，并具有高重复性。,Prof. Du Guanhua,45,高内涵筛选技术,采用新方法和分析技术的细胞水平检测模型将能够浓缩系列药物发现过程，减少候选化合物进入临床的时间和成本。,Prof. Du Guanhua,46,从基因到药物的策略,基因相关的药物改变基因的
21、药物人类的福兮祸兮？ 作用于基因的药物功能调节的环节，直接间接？ 作用于蛋白质的药物主要药物作用途径，靶点，活性物质（药物） 作用于细胞的药物反映细胞整体作用（多靶点，多途径？） 作用于组织的药物改变集体条件，（外科？）从基因到药物的主要途径应该是药物靶点的发现,Prof. Du Guanhua,47,从基因到药物的策略,1、基因功能的药物干扰2、基因功能的化合物模拟3、生理功能的基因基础到药物干预,Prof. Du Guanhua,48,发展和挑战,高通量药物筛选的发展，在技术、方法、信息和物质等方面已经奠定了良好的基础，庞大化合物库的建立和大量新技术的产生，具备了新药发现的基本条件。 药物发现是药物研发的核心内容。各种技术的有效整合是非常重要的途径。 我国的创新药物的发现需要扎实、艰苦并富有创造性的工作。,Prof. Du Guanhua,49,Thank you !,
