1、中药指纹图谱 研究技术,中华中医药学会中药化学分会委员周玉新,内 容,一、中药指纹图谱技术概述 二、中药指纹图谱研究指导原则 三、指纹图谱研究的相似度计算 四、中药指纹图谱的研究方法与思路 五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）,一、中药指纹图谱技术概述,（一） 中药指纹图谱与中药质量 （二） 中药指纹图谱研究方法学 （三） 中药指纹图谱技术的发展,指 纹 图 谱,稳 定 性,可 控 性,安 全 性,有 效 性,1. 中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系,（一） 中药指纹图谱与中药质量,2. 国内中药质量评价现状,植物学方法： 原植物鉴定，显微鉴定等 植物化学方法： 理化鉴定 分析化学方法：
2、 仪器分析，色谱分析等 药理学方法： 生物鉴定法，生物等效等 分子生物学方法: DNA指纹鉴定,3. 国外植物药质量评价概况,标准制剂：银杏 人参 西洋参 五味子甘草 黄芪 贯叶连翘 定量测定结合主成分比例 固定产地以生产质量恒定制剂 多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱,4. 中药指纹图谱的意义,是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳定性 有利于中药及其产品进入国际市场,5. 中药指纹图谱建立的原则,系统性： 指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位所含大部成分的
3、种类，或指标成分的全部 特征性： 指纹图谱中反映的化学成分信息（具体 表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，是这些信息的综合结果 稳定性： 指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致的指纹图谱 色谱特征的稳定性： 特征峰特征区 特征参数色谱条件稳定性： 不同仪器的验证 不同实验室的验证不同操作者的验证, 品种鉴别-真伪基源鉴别-产地药用部位的鉴别-根、茎、叶、花、 果提取工艺药材炮制限量成分的控制一致性-不同批次的产品.,6. 指纹图谱研究目的,品种多、产地多;采收、加工不一致化学组分与含量不同（产品品质优劣不同）有效组分种类繁多、含量相对少；非有效组分成分复杂、含量高分析检测困难（质
4、量控制指标不统一）基础研究薄弱药材GAP建设滞后,7. 建立中药指纹谱所面临的问题,8. 对 策,加强GAP药材种植基地建设 加强中药种植与加工、炮制的规范化 加强中药化学成分的基础研究 应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究,仪 器 设 备技 术 人 员研 究 经 验系统性问题稳定性问题特征性问题,9. 中药指纹谱研究过程中面临的问题,色谱法1. 液相色谱法（LC）2. 气相色谱法（GC）3. 薄层扫描法（TLC）4. 毛细管电泳法（CE）其它1. 质谱法（MS）及色谱与质谱联用2. X-衍射法3. 近红外法（NIR）等,（二） 中药指纹图谱研究方法学,（三） 中药指纹图谱技术的发展,应用
5、范围仪器设备与软件指纹图谱标准,二、 中药指纹图谱研究指导原则,（一）目的和要求 （二）中药指纹图谱标准起草说明 （三）中药指纹图谱标准的建立,中药质量研究和质量标准的一个重要内容 加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控 固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，需制定原料药(中药材)和注射剂的指纹图谱,（一）目的和要求,（二）中药指纹图谱标准起草说明,1. 名称、汉语拼音,2. 来源（产地、采收期、炮制）,按中药的命名原则制定,药 材：产地、采收期、炮制 中间体：提取工艺或提取物的来源,3. 供试品溶液的制备有效成分(专属性成分、指标性成分)的理化性投质并结合
6、检测方法的要求提取工艺参照物溶液的制备对照品内标物标准提取物,中药指纹图谱检测方法的验证（1）检测方法测定方法、 仪器 、 试剂 、 测定条件（2） 验证 专属性 （空白试验）精密度试验（RSD3%）重复性与重现性试验（S0.95）稳定性试验（S0.95）系统适应性试验6. 指纹图谱的相关性,（三）中药指纹图谱标准的建立,注意事项（1）所有成分应在2小时左右洗脱，并提供2小时的指纹图谱（2）可建立各个组分的指纹图谱（3）可建立多种方法的指纹图谱（4）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱，或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱,2. 指纹图谱标准的建立（1）药材、中间体指纹
7、图谱标准为企业内控标准，列入起草说明（2）10批供试品（3）标准的规定：供试品的指纹图谱与对照提取物（标准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。,指纹图谱标准书写格式,液相色谱法【指纹图谱】 照高效液色谱法（中国药典一部附录VI D），结合指纹图谱的要求测定。色谱条件及系统适用性试验 如以对照品做系统适用性试验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。对照品溶
8、液的制备 如有对照品则照中国药典书写格式。供试品溶液的制备 精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各 XX ml，分别流入液相色谱仪，测定。本品指纹图谱的主要特征 供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相似度大于 XX，符合要求（或相似度小于 XX，不符合要求）。,三、指纹图谱研究的相似度计算,（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法 （二）、指纹图谱相似度计算原理 （三）、指纹图谱相似度评价软件,（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法,原则：整体性、模糊性、特征性方法：直接观察、计算机辅助相似性计算,1. 引用参数 2. 数据获取途径
9、3. 相似度算法,（二）、指纹图谱相似度计算原理,1. 引 用 参 数, 保留时间(RT) 峰高(Height) 峰面积(Area) 峰面积百分比（Area%） 相对保留时间（Ratio of Retention Time, RRt） 积分相对比值（Ratio of Area, RA）,2. 数 据 获 取 途 径,（1）图形/图像转化成ASCII数据 （2）截片数据 （3）色谱数据,3. 相 似 度 算 法,夹角余弦算法,相关系数算法,优 化 算 法,1. 软件开发原则 2. 市售/常用软件简介 3. 相似度软件使用过程中应注意的问题,（三）、指纹图谱相似度评价软件,1. 软 件 开 发 原
10、 则,系统独立性 (2) 计算方法的科学性(3) 数据接口通用性 (4) 操作过程及应用的实用性,2. 市售/常用软件简介,浙江大学 陈一宇教授 中南大学 梁逸增教授 沈阳药科大学 毕开顺教授 西北大学 李华教授 二军大 Waters,3. 相似度软件使用过程中应注意的问题,数据接口与数据类型数据的校正算法的选择,四、中药指纹图谱的研究方法与思路,（一）、研究方案设计 （二）、样品的选择与收集 （三）、供试品的制备 （四）、指纹图谱色谱条件研究的思路 （五）、相似度值的研究与指纹特征,（一）、研究方案设计,资料收集与整理文献、工艺资料、质量标准方案的设计（1）研究对象-有效成分（2）研究方法的
11、选择-色谱法(HPLC GC TLC)及其它方法（3）研究内容-根据技术要求的规定：包括“名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明”,（二）、样品的选择与收集,要求：10个批次道地药材与GAP基地药材典型性与代表性离散样品的剔除,（三）、供试品的制备,依据：有效组分的物理化学性质生产或提取工艺检测方法的需要,（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路,高效液相色谱法 HPLC气相色谱法 GC,（1） 检测波长的选择 （简） （2） 柱温的选择 （略） （3） 进样量 （简） （4） 色谱柱的选择 （重点） （5） 检测成分的选择 （重点） （6） 流动相（梯度表）的选择 （重点）,1. 高 效
12、液 相 色 谱 法 HPLC,示例：蜂胶(Bee Propolis),（1） 检测波长的选择,=280nm,=360nm,=254nm,=210nm,波长选择：=280nm,（4） 色谱柱的选择,选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：Eka-Nobel的Kromasi C18 (5mm)，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的Kromasi色谱柱，还是国外公司填充的Kromasi色谱柱，在分离效果上基本相同。因此对于大多数中药注射剂，可选用Kromasi色谱柱。如选用乙腈-缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱： 如为酸性缓冲溶液，可选用Zorbax SB-C18色谱柱（pH
13、6）。示例：不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果,Lichosorb,Polaris,Kromasil,Diamonsil,Carbosorb,（5） 检测成分的选择 （重点）,示例：何首乌,何首乌生品的液相色谱图（全局图）,何首乌生品的液相色谱图（局部放大图）,图9 上海制首乌指纹图谱,北京良方药业制首乌,北京金象药店制首乌,北京寿春堂药店制首乌指纹图谱,（6） 流动相（梯度表）的选择,主要影响因素1. 起始浓度2. 梯度速率3. 流速,* 为体积百分比（V/V）,指纹图谱流动相梯度优化,* 为体积百分比（V/V）,梯 度 表,初始色谱条件,初始色谱条件的设定依据及目的,依据：化合物极性大小。
14、如未知时，假设有效组分中包含各种极性的成分。 目的：快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相的组成，为优化条件的选择提供依据。,优化条件的选择,选择依据：初始色谱图、梯度洗脱表及一定的经验 示 例：（1）淫羊藿总黄酮（40%）提取物（2）钩藤总生物碱（3）黄连药材（4）知母总皂苷,淫羊藿提取物在初始条件下的色谱图,淫羊藿提取物第一次优化后的色谱图,梯度速率：初始：100/60min=1.7 /min优化：01.7,CH3CN%,CH3CN%,Min,Min,初始条件,CH3CN%,Min,三七 人参 西洋参,CH3CN%,Min,起始浓度： 根据初始色谱图中主要色谱峰被洗脱时的流动相组成，相应
15、减少20%。流 速： 0.52.0 ml/min,2. 气 相 色 谱 法,（1）影响色谱峰分离程度的因素色谱柱的类型载气流速起始柱温升温速率,（2）研究示例样品：广藿香油指纹图谱研究过程,方案设计,检测方法（1）色谱方法广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到的挥发油，均为易挥发组分，拟采用气相色谱法（GC）。（2）仪器：Agilent 6890 GC（3）色谱柱的选择 可供选择的色谱柱：极性 非极性 中等极性 （4）进样方式的确定 手动 自动 顶空,2. 供试品溶液的制备取广藿香油适量，加醋酸乙酯溶解，即得。,注：对于非极性毛细管色谱柱，如供试品溶液中含少量的少，最好干燥后进样。,2. 色谱
16、条件的摸索（1）对梯度速率及流速进行微调-由粗到精,初始条件流 速： 3.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 30 /min,第一次优化流 速： 2.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 20 /min,第二次优化流 速： 1.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 10 /min,第三次优化流 速： 1.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率：
17、 5 /min,第四次优化流 速： 0.5 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 5 /min,（2）选择细化的初始条件-由细到精,初始条件流 速： 1.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 1.0 /min,第一次优化流 速： 1.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 150 升温 速 率： 1 /min,（3）根据初始条件（由粗到精）下的色谱图，计算大多数色谱峰出峰时的柱温范围，确定第一次优化时柱温的梯度变化范围。,初始条件,
18、结果： RT=7min后，基本没有色谱峰；RT=8min后，基线平直。主要色谱峰被洗脱时的RT：4min7min主要色谱峰被洗脱时的柱温范围：170250,第一次优化流 速： 1.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 100 升温 速 率： 5 /min,第二次优化流 速： 0.5 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 100 升温 速 率： 5 /min,结 论对本供试品中的组分的分离，升温速率是主要影响因素，载气（N2）的流速是次要因素。本供试品中的挥发性组分，其沸点相对较高，故应相应提高初始柱温的设置值。载气（N2）的流速的调整可改善色谱峰的分离。注意的问题条件优化的目的：应尽可能使每个色谱峰为单一色谱峰保证大多数峰及/或含量较高的成分达到基线分离。初始柱温的设置梯度变化的速率保留时间 最佳30min溶剂空白,1.注意的问题溶剂色谱峰-色谱纯试剂杂质（敷料）色谱峰-分离提取相似度值的计算3. 指纹特征特征指纹峰与特征指纹区,（五）、相似度值的研究与指纹特征,指纹图谱研究过程中的复杂样品的选择有效组分的复方制剂 西洋参与淫羊藿,
