1、2018/12/17,分子生物学原理,第 十 一 章,RNA的生物合成 （转录） RNA Biosynthesis, Transcription,2018/12/17,分子生物学原理,转录,转录 (transcription),生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 也就是把DNA的碱基序列抄录成RNA的碱基序列。,2018/12/17,分子生物学原理,复制与转录的异同点,相同点： 不同点:复制 转录以DNA作模板 双链复制 模板链需4种NTP dNTP NTP碱基配对 A=T A=U,T=A合成方向53依赖DNA的聚合酶 DDDP DDRP多聚核苷酸大分子 半保留式子代 mRNA、tRNA
2、、rRNA,2018/12/17,分子生物学原理,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白质因子,2018/12/17,分子生物学原理,模板和酶 Templates and Enzymes,第一节,2018/12/17,分子生物学原理,一、转录模板,结构基因：strucural gene能转录出mRNA然后指导蛋白质生成 的部分。 模板链：template strand可作为模板转录成RNA的一股链。也称作有意义链或Watson链。 编码链：coding strand相对
3、于模板链的另一股链。也称为反义链或Crick链。,2018/12/17,分子生物学原理,模板: 转录、翻译的序列比较,5 GCATTAGCTAGCTACTAGC 3 DNA 3 cgtaatcgatcgatgatcg 5 双链转录 5 GCAUUAGCUAGCUACUAGC 3 mRNA翻译 N AlaLeuAlaSerTry C 肽链,2018/12/17,分子生物学原理,转录的不对称性,不对称转录：asymmetric transcription DNA双链对一个基因而言，一股可转录，另一股不转录。 模板链与编码链相对而言,2018/12/17,分子生物学原理,5 3,3 5,模板链,编码
4、链,编码链,模板链,结构基因,2018/12/17,分子生物学原理,二、 RNA聚合酶,转录酶：依赖DNA的RNA聚合酶DNA dependent RNA polymeraseDDRP,2018/12/17,分子生物学原理,原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌的RNA聚合酶：2 其中2称为核心酶：只有转录功能 亚基：辨别转录起始点 +2=全酶 受利福平或利福霉素（结核菌药物）的特异性抑制。,2018/12/17,分子生物学原理,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),2018/12/17,分子生物学原理,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2018/12/17,分子生物
5、学原理,原核生物的RNA聚合酶,2018/12/17,分子生物学原理,真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶II可认为是真核生物中最重要的RNA聚合酶,2018/12/17,分子生物学原理,三、模板与酶的辨认结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,2018/12/17,分子生物学原理,三、模板与酶的辨认结合,启动区的保守序列 原核生物有两个元件 -35bp的辨认位点：5-TTGACA- -10bp的Pribnow盒: 5-TATAATP
6、u 真核生物有多个元件(如-30的Hogness或TATA盒)。,2018/12/17,分子生物学原理,RNA聚合酶保护法,目 录,2018/12/17,分子生物学原理,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点 (recognition site),2018/12/17,分子生物学原理,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,2018/12/17,分子生物学原理,转录过程 The Process
7、 of Transcription,第二节,2018/12/17,分子生物学原理,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,2018/12/17,分子生物学原理,2. DNA双链解开,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程,2018/12
8、/17,分子生物学原理,转录起始中的事件,解链 形成转录空泡 为首的为三磷酸GTP或ATP 转录起始复合物(RNA-聚合酶全酶-DNA-pppGpN-OH) 第一个磷酯键形成后， 亚基从转录起始复合物中脱落下来。RNA聚合酶沿DNA链向前移动。,2018/12/17,分子生物学原理,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,2018/12/17,分子生物学原理,（二）转录延长,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n +
9、NTP (NMP) n+1 + PPi,2018/12/17,分子生物学原理,转录的延长,转录的延长是以5到3的方向进行的。 (NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi 以G=C、A=U、T=A碱基配对。 转录完成部分的DNA重新形成双链。 较长的RNA链上有核糖体结合，说明在某些情况下，转录的同时，翻译已经开始进行了。,2018/12/17,分子生物学原理,2018/12/17,分子生物学原理,转录的过程,2018/12/17,分子生物学原理,转录的延长,2018/12/17,分子生物学原理,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,2018/12/17
10、,分子生物学原理,（三）转录的终止,转录终止：是RNA聚合酶在模板上的某一位置停顿，RNA链从转录复合物上脱离出来。 分为依赖Rho因子的转录终止和不依赖Rho因子的转录终止。,2018/12/17,分子生物学原理,1、依赖Rho因子的转录终止,Rho因子的左右是使RNA-DNA杂化双链的短链变性，从而有利于转录产物从转录复合物中释放出来。,2018/12/17,分子生物学原理,A T P,1. 依赖 Rho因子的转录终止,2018/12/17,分子生物学原理,2. 非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,
11、2018/12/17,分子生物学原理,2、非依赖Rho因子的转录终止,2018/12/17,分子生物学原理,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUU
12、UU. 3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,2018/12/17,分子生物学原理,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,2018/12/17,分子生物学原理,不依赖Rho因子的转录终止模式,RNA链出现茎-环结构，促进 转录的终止。 1.这样的结构改变RNA聚合酶 的构象，使酶不再向下移动。 2.DNA和RNA各自形成自己的 局部双链，使杂化链更加不稳 定，以致转录复合物趋于解 体。 接着的一串寡聚U，则更是促 进RNA新链从模板上脱落的 促进因素。,2018/12/17,分子生物学原理,二、真核生物的转录起始,
13、（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,2018/12/17,分子生物学原理,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),1. 转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2018/12/17,分子生物学原理,2. 转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factor
14、s)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。,2018/12/17,分子生物学原理,参与RNA-pol转录的TF,2018/12/17,分子生物学原理,3. 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,2018/12/17,分子生物学原理,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完
15、成，TFH使CTD磷酸化,2018/12/17,分子生物学原理,4. 模板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,2018/12/17,分子生物学原理,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,2018/12/17,分子生物学原理,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体
16、移位,转录方向,2018/12/17,分子生物学原理,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止, 和转录后修饰密切相关。,2018/12/17,分子生物学原理,真核生物转录终止的特点,真核生物mRNA带有聚腺苷酸尾巴的结构，这是转录之后加上的。 在模板链读码框架的3端之后，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。,2018/12/17,分子生物学原理,转录与复制的相似之处,都以DNA为模板
17、 需要核苷酸作原料，从5到3延长；生成磷酸二酯键以连接核苷酸 都遵从碱基配对规律 都需要依赖DNA的聚合酶 产物都是很长的多核苷酸,2018/12/17,分子生物学原理,转录和复制的区别,2018/12/17,分子生物学原理,真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification,第三节,2018/12/17,分子生物学原理,转录后的修饰,转录生成的RNA，称为初级转录产物。 无论在真核生物或原核生物中，初级转录产物都经过一定程度的修饰加工，才能表现其功能。,2018/12/17,分子生物学原理,几种主要的修饰方式,1. 剪接(splicing),2. 剪切(
18、cleavage),3. 修饰(modification),4. 添加(addition),2018/12/17,分子生物学原理,一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp )3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),2018/12/17,分子生物学原理,帽子结构,2018/12/17,分子生物学原理,5 pppGp,帽子结构的生成,2018/12/17,分子生物学原理,真核生物mRNA的转录后加工,5和3首尾的修饰 剪接,2018/12/17,分子生物学原理,5加帽,转录产物的第一个核苷酸pppG水解成5-ppG或5-pG 与另一个三磷
19、酸鸟苷生成三磷酸双鸟苷 第二个鸟嘌呤被甲基化 加帽出现在hnRNA中，说明可能在细胞核中完成，并在剪接之前。,2018/12/17,分子生物学原理,3端加上聚腺苷酸尾巴,真核生物mRNA中poly A的出现是不依赖于DNA模板的。 加入poly A之前，先由核酸外切酶切去3末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA。 3端修饰也是在细胞核中，在剪接之前进行的。 Poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定性。,2018/12/17,分子生物学原理,3端修饰示意图,2018/12/17,分子生物学原理,（二）mRNA的剪接,1. hnRNA 和 snRNA
20、,核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA),2018/12/17,分子生物学原理,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,2018/12/17,分子生物学原理,2. 外显子(exon)和内含子(intron),外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被
21、除去的核酸序列。,2018/12/17,分子生物学原理,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,2018/12/17,分子生物学原理,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,2018/12/17,分子生物学原理,真核细胞mRNA的剪接,DNA模板与hnRNA是完全配对的，而成熟的mRNA与hnRNA或DNA杂交都只是部分配对。 因此真核生物的基因有断裂性。,2018/12/17,分子生物学原理,断裂基因,真核生物的结构基因，由若干个编码区被非编码区相互间隔开，但又连续镶嵌而成，因此真核生物的基因称为断裂基因
22、。 外显子代表了基因上编码氨基酸的核苷酸序列。 内含子表示相应的非编码序列。 原核生物结构基因是连续的编码序列，不是断裂基因。,2018/12/17,分子生物学原理,内含子的种类,线粒体，叶绿体转录初级rRNA基因 线粒体，叶绿体的mRNA 形成套索状结构的剪接，由SnRNA和核内蛋白形成的核小核糖核酸蛋白来完成。 tRNA基因。,2018/12/17,分子生物学原理,3. 内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大
23、多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,2018/12/17,分子生物学原理,4. mRNA的剪接, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,2018/12/17,分子生物学原理,2018/12/17,分子生物学原理,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twice transesterification),2018/12/17,分子生物学原理, RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differentia
24、l RNA processing)。,5. mRNA的编辑(mRNA editing),2018/12/17,分子生物学原理,内含子的功能,内含子有利于物种的进化选择 调节功能,2018/12/17,分子生物学原理,tRNA的转录后加工,初级产物中有5端的16个碱基和反密码子后的14个碱基需要去除。,2018/12/17,分子生物学原理,二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,2018/12/17,分子生物学原理,2018/12/17,分子生物学原理,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,2018/12/17,分子生物学原理,碱基修饰,2018/12/17,分子生物学原理,涉及加工的反
25、应,甲基化 还原 核苷内的转位反应 脱氨反应 3端加上CCA-OH,2018/12/17,分子生物学原理,三、rRNA的转录后加工,2018/12/17,分子生物学原理,rRNA的转录后加工,丰富基因：染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因单位的重复。 真核细胞的rRNA基因属于丰富基因。 45s的转录产物是三种rRNA的前体，经过剪接后形成核糖体小亚基的18S rRNA，其余形成5.8S及28S的rRNA。,2018/12/17,分子生物学原理,四膜虫rRNA的结构,2018/12/17,分子生物学原理,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列
26、,2018/12/17,分子生物学原理,核酶(ribozyme),核酶：RNA本身具有催化活性，此种由RNA发挥催化作用的酶，称为核酶。 最简单的核酶呈槌头结构。,2018/12/17,分子生物学原理,最简单的核酶二级结构槌头状结构 (hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,2018/12/17,分子生物学原理,核酶发现的意义,对传统酶学提出了挑战 对进化的研究有帮助 人工核酶应用于疾病的治疗。,2018/12/17,分子生物学原理,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充； 核酶的发现是对传统酶学的挑战； 利用核酶的结构设计合成人工核酶 。,2018/12/17,分子生物学原理,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子 细线表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭头表示切断点,2018/12/17,分子生物学原理,附录,2018/12/17,分子生物学原理,四膜虫RNA的自我剪接,
