1、第三讲,植物组织培养操作流程,一 实验目的,植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可使同学初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。,二 实验原理,1.植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物的全能性。植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。,2、植物组织培养的发展 1904年，德国植物胚胎学家Haning用萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得组培的成功。 1922年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培育获得成功 1933年，我国李继侗等进行银杏离体胚培养获得成功。,3、植物组织培养的应用 在作物育种上的应用（单倍体植株
2、、种间杂交、细胞融合、细胞突变、种质保存和基因工程）。 在作物脱毒和快速繁殖上的应用。 在遗传、生理生化和病理研究上的应用。,4、植物组织培养的内容植物组织培养包括以植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体为外植体的离体无菌培养，拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞和原生质的培养技术。（植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养 ）,石斛植物的芽培养,长春花的胚性细胞培养,黄芪的发状根固体培养,黄芪发状根的液体培养,5、植物组织培养中的重要概念 愈伤组织：指由植物的一种组织或器官经历脱分化形成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的潜能； 外植体：
3、植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等； 无菌和消毒：,烟草愈伤组织,诱导一周的烟草愈伤组织,长春花的胚性细胞培养,三 实验材料,烟草（Nicotiana）属茄科植物，是重要的工业原料，是组织培养中研究的最为广泛的植物材料。 豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株。,四 实验要求,1、实验开始前，值日生将地板拖洗一遍，所有同学将自己的实验台擦洗一遍，同组两位同学请先认真研究好实验步骤，明确合作和分工，以加快实
4、验速度，减少染菌机会，实验开始后，请尽量不要走动，有事请举手。,2、无菌操作要注意：每次操作前，将双手用酒精棉球擦拭消毒；解剖针、解剖刀等金属工具用火焰烧过灭菌，在酒精中冷却，再将酒精烧去方可使用；尽量减少无菌三角瓶和培养皿在空气中的暴露时间；所有无菌操作尽量快速完成，并请在酒精灯附近进行。,3、请先用带菌豌豆练习茎尖解剖，经检查无误，操作熟练后，再进行无菌解剖及接种，以减少植物材料染菌或失水死亡的机率。,五 实验内容,.烟草无菌苗的快速切繁继代 培养 .烟草的愈伤组织培养 .豌豆苗的茎尖培养,组 培 实 验 用 品,一、烟草无菌苗的快速切繁,1、点着酒精灯，双手擦拭消毒，打开长有无菌烟草苗的
5、三角瓶，三角瓶瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭菌。 2、用灭菌的镊子轻轻捏出幼苗，放在无菌的培养皿中，用灭菌的剪刀将主茎剪成若干0.5-1cm的小段，要求每段至少包含一个生长点，接入盛有MS培养基的三角瓶中，每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口重新烧过灭菌，并重新封好。 3、在光照培养箱中，25，16小时光照条件下培养4周，可长成完整植株。,1、点着酒精灯,2、双手擦拭消毒,3、剪刀灭菌,外焰,4、酒精中冷却,5、把酒精烧去,6、打开三角瓶铝箔纸的拿法a,7、打开三角瓶铝箔纸的拿法b,8、瓶口在火焰上烧过,9、铝箔纸的放法,10、镊出烟草苗a,11、镊出烟草苗b,12、放入培养皿中,13、
6、烟草幼苗形态生长点,14、剪取茎段,15、剪好的烟草苗,培养皿的拿法,16、烟草茎段接种a,17、烟草茎段接种b,18、接种好的烟草苗a,19、接种好的烟草苗b,20、重新封好瓶口a,21、重新封好瓶口b,22、重新封好瓶口c,23、重新封好瓶口d,24、写好班级和组号,二 烟草愈伤组织的培养,、挑选生长健康的无菌烟草叶或茎，在灭菌的培养皿中剪成0.5-1cm2的小块或相当大小的茎段(造成伤口), 接种在盛有MS培养基的培养皿中将培养皿用封口膜封住。 、在光照培养箱中，25下,16小时光照，培养两周，可形成愈伤组织。,1、将烟草苗剪出伤口,2、剪好的烟草叶片和茎段,3、打开培养皿,4、烟草愈伤
7、组织接种a,5、烟草愈伤组织接种b,6、培养皿封口,7、写好班级和组号,8、酒精灯熄灯法a,9、酒精灯熄灯法b,三、豌豆苗的茎尖培养,、取豌豆幼苗10株，剪取1cm左右的茎尖浸入70%的酒精1分钟消毒液中15分钟无菌水冲洗5次灭菌的滤纸上吸干放入灭菌的培养皿。 、在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，挑取带着两至三个叶原基的生长锥。移到盛有B5培养基的培育皿中，诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。 、在恒温培养箱中，26下,培养六周，可形成簇生芽丛。,1、豌豆幼苗形态,2、剪取豌豆茎尖,茎尖,3、剪好的豌豆茎尖,4、倒入70%酒精处理1分钟,5、倒去酒精,6、倒入消毒液处理15分钟,7、倒去消毒液,8、无菌水冲洗5次,9、取出茎尖,10、在滤纸上吸干水分,11、双目解剖镜下解剖豌豆茎尖,显微解剖镜使用图解,目镜,放大倍数 旋钮,物镜,解剖载物台,焦距旋钮,底光源开关,上光源调节 旋钮,六、实验结果观察,1、两周以后观察烟草愈伤组织的形成情况。 2、四周后，观察烟草幼苗的成长情况。 3、六周后，观察豌豆愈伤芽丛的生长情况。 4、每人一份实验报告，当堂上交。 （包括目的和对无菌概念的认识）,解剖镜下剥取豌豆茎尖演示一,
