1、第四节 微生物的固氮作用,氮是组成生物细胞必不可少的重要元素之一。氮气(N2)约占空气总体积的78%，但由于N N三键非常稳定，故N2不能被高等生物和大多数微生物利用，只有少数原核微生物能直接 利用N2作氮源，将其还原成氨，供植物和其他微生物利用。固氮微生物利用固氮酶的催化 作用将分子态氮转化为氨的过程称为生物固氮。生物固氮是地球上仅次于光合作用的第二大生物化学反应。生物每年在温和条件下的固氮量约为高温高压(300300个大气压)条件下工业固氮量的2倍多，约为1亿吨，故生物固氮对地球生态系统中的氮素循环和生物的生息繁衍具有十分重要的作用。,1.固氮微生物的种类, 自1886年M.W.Beije
2、rinck分离到能共生固氮的根瘤菌后，人们共发现了50多属100多种生物有固氮能力，这些生物均为原核生物。按其固氮方式可分为3种类型：能独立固氮的微生物称为自生固氮菌；必须与其他生物共生才能固氮的微生物称为共生固氮菌；必须生活在植物根际、叶面或肠道等处才能固氮的微生物称为联合固氮菌。,自生固氮菌 好氧化能异养：固氮菌属(Azotobacter)拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)固氮单胞菌属(Azomonas)固氮球菌属(Azococcus)德克斯氏菌属(Derxia)黄色分枝杆菌(Mycobacterium flavum) 自养棒杆菌(Corynebacterium autotroph
3、icum) 产脂螺菌(Spirillum lipoferum)甲烷氧化菌等,化能自养：氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferroxidans光能自养：念珠蓝菌属(Nostoc)鱼腥蓝菌属(Anabaena)着色菌属(Chromatium)绿假单胞菌属(Ch loropseudomonas)微好氧 (化能异养)：棒杆菌属(Corymebact erium)固氮螺菌属(Azospirillum),兼性厌氧化能异养：克雷伯氏菌属(Klebsiella)无色杆 菌属(Achromobacter)多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)柠檬酸杆菌属(Cit robacter)欧文氏菌
4、属(Erwinia)肠杆菌属(Enterobacter)光能异养：红螺 菌属(Rhodospirillum)红假单胞菌属(Rhodopseudomonas) 厌氧化能异养：巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)脱硫弧菌属(Desulforibrio)脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum) ,共生固氮菌 根瘤豆科植物： 根瘤菌属(Rhizobium) 非豆科植物： 弗兰克氏菌属放线菌(Frankia) 白蚁等动物肠道： 肠杆菌属(Enterobacter) 植物地衣： 念珠蓝菌属(Nostoc)鱼腥蓝菌属(Anabaena)(单歧蓝菌属) 等(Tolypothri
5、x) 满江红： 满江红鱼腥蓝菌(Anabaena azollae) 苏铁珊瑚根： Nostoc,A nabaena 肯乃拉草： Nostoc,联合固氮菌根际温带：Bacillus，Klebsiella热带：雀稗固氮菌(Azotobacter paspali)，Azospirillum,Beijerinckia叶面：Beijerinckia, Azoto bacter,2.固氮的生化机制,固氮酶：生物固氮反应的核心。1960年，J.E.Carnahan从巴氏梭菌(Clost ridium pasteurianum)中获得了具有固氮活性的无细胞抽提液，实现了分子氮还原为NH3 的实验。1966年，
6、L.Mortenson从巴氏梭菌(C.Pasteurianum)和维涅兰德固氮菌(Azotobacte r vinelandii)的无细胞抽提液中，分离出两种固氮蛋白钼铁蛋白和铁蛋白，使固氮研究进入分子水平。,固氮反应的必要条件： 大量ATP还原力NAD(P)H2固氮酶N2Mg2+严格的厌氧微环境固定1mol N2需要消耗1015molATP 。这些ATP由呼吸、发酵或光合磷酸化过程提供。从不同生理类型的固氮微生物细胞中抽提到的固氮酶具有相同结构，它们均含、两种组分。组分为钼铁蛋白(MF)或钼铁氧还蛋白(MoFd)，是真正的“固氮酶”；组分为铁蛋白(F)，是固氮酶还原酶。,固氮酶的、两种组分项
7、目 组分 组分 蛋白质亚基数 4(2大2小) 2(相同)分子量 22万左右 六万左右Fe原子数 30(2432) 4 不稳态S原子数 28(2032) 4Mo原子数 2 0Cys的SH基数 3234 12活性中心 铁钼辅因子(FeMoCo) 电子活化中心(Fe4S4)功能 络合、活化和还原N2 传递电子到组分上,固氮酶活力测定：测定固氮酶活力的经典方法有微量K氏定氮法和同位素法，但前者精度低，后者程序复杂。1966年，M.J.Dilworth等发表了灵敏简便的乙炔还原法，促进了固氮酶活性及固氮机理研究。该法的理论依据是：固氮酶除了能催化N2 NH 3外，还能催化C2H2(乙炔) C2H2(乙烯
8、)及2H+ H2等多种反应。乙炔还原反应中产生的乙烯及底物乙炔即使浓度很低，也能方便地用气相色谱仪测定。该测定方法灵敏度高、设备简单、成本低及操作简便，可用于纯酶制剂及自然固氮生态体系的固氮活力测定。,固氮的生化途径固氮总反应式为：N2 + 6e + 6H+ + 12ATP 2NH3 + 12ADP + 12PiN2分子经固氮酶催化还原为NH3，再通过转氨途径形成各种氨基酸。固氮酶除具有固氮功能外，还能催化2H+ H2。在缺N2条件下，固氮酶可将H+全部还原为H2；在有N2条件下，固氮酶将75%的NAD(P)H2用于N2的还原，另外25%的NAD(P)H2形成H2浪费掉。但在大多数固氮菌中，含
9、有氢酶，可将固氮催化形成的无效H2重新转化为NAD(P)H2和ATP。,图氮的生化途径,图氮的生化途径,N2经根瘤菌被植物吸收,3.固氮菌的抗氧机制,固氮酶的两个蛋白组分对氧极端敏感，一旦遇氧就可发生不可逆失活。组分(铁蛋白)在空气中暴露45秒其酶活丧失一半，组分在空气中的活性半衰期约为10min。不同固氮微生物的钼铁蛋白具有不同的氧敏感性。大多数固氮菌为好氧菌，它们需要氧气进行呼吸和产能。固氮菌在长期的进化中形成了许多巧妙的机制，解决了细胞 需氧和固氮酶厌氧的矛盾。,不同固氮菌钼铁蛋白的氧敏感性名称 半衰期(min)大豆根瘤菌 4.5肺炎克雷伯氏菌 8.0维涅兰德氏固氮菌 10.0圆褐固氮菌
10、 10.0巴氏梭菌 60,好氧自生固氮菌的保护机制：抗氧方式主要有两种：呼吸保护和构象保护。 固氮菌以较强的呼吸作用迅速将周围环境中的氧消耗掉，使细胞周围微环境处于低氧态，以保护固氮酶不受氧损伤，该抗氧方式称为呼吸保护。本机制存在的证据：属于固氮菌科(Azotobacterlaceae)的固氮菌都具有特别高的呼吸强度。例如，把生长在低氧分压下的A.vinelandii突然转移到高氧分压下培养时，其呼吸强度和NADPH2脱氢酶活性同时增高，细胞色素a2的含量增加，而氧化磷酸化的效率却明显降低。其原因在于细胞动用了一套消耗碳源除氧以保护固氮酶 的呼吸系统。,构象保护指固氮菌处于高氧分压环境下时，其
11、固氮酶能形成一个无固氮活性但能防止氧损伤的特殊构象。该构象是由固氮酶与蛋白质或磷脂等稳定因子结合形成的。呼吸与构象两种保护互相协调，形成“双保险”机制。在一般含氧条件下，呼吸保护就可除去多余氧；若还有 过量分子氧，可利用构象保护使固氮酶免遭损害。,蓝细菌的固氮酶保护：蓝细菌是放氧光合生物。在光照下，通过光合作用放氧使细胞内的氧浓度增高。两种防氧措施：异形胞抗氧和非异形胞抗氧,异形胞抗氧机制：异形胞为一种特化细胞，个体较营养细胞大，细胞外有一层由糖脂组成的较厚的外膜，该膜具有防止氧气扩散进入细胞的物理屏障功能；异形胞内缺少产氧光合系统，脱氢酶与氢酶活性高，使异形胞内维持在很强的还原态；胞内超氧化
12、物歧化酶SOD( Superoxide dismutase)活性很高，有解除氧毒害的功能；异形胞比相邻营养细胞的呼吸强度高2倍，可通过呼吸消耗过多的O2并产生固氮所需ATP。,非异形胞抗氧有多种形式：利用时间差解决固氮酶厌氧和光合放氧的矛盾，即在黑暗下固氮，在光照下进行光合作用(织线蓝细菌属)；提高细胞内SOD和过氧化物酶活性，消除有毒过氧化物，保护固氮酶活性(粘球粘细菌属)。,根瘤菌固氮酶的保护：根瘤菌分为豆科根瘤菌与非豆科根瘤菌两种类型。豆科根瘤菌以只能生长不能分裂的类菌体(bacteroids)形式存在于豆科植物的根瘤中。许多类菌体被包裹在一层类菌体周膜中，膜内具有良好的氧、氮和营养条件
13、。最重要的是在周膜内外存在着独特的豆血红蛋白(leghaemoglobin)。该蛋白具有极强的吸氧能力，可使近血红蛋白处的氧浓度比周围环境降低8万倍，以防止类菌体周围氧浓度过高使固氮酶失活。豆血红蛋白犹如氧缓冲剂，可调节根瘤中氧的浓度，使其稳定在固氮酶的最适范围内。豆血红蛋白的蛋白质部分由根瘤菌触发，植物基因编码合成；血红素由植物触发，根瘤菌基因编码合成 。,1973年发现，在一种生长于非州的非豆科植物榆科糙叶山黄麻(Parasponia)的根瘤中存在着豇豆根瘤菌，根瘤中无豆科植物根瘤中常见的豆血红蛋白，但却含有与豆血红蛋白功能相似的植物血红蛋白，保护着固氮酶不受氧之危害。在赤杨、杨梅及木麻黄等非豆科木本植物的根瘤中，存在着与之共生的弗兰克(Frankia)放线菌。该菌的营养菌丝未端有一膨大的球形囊泡囊，固氮反应在泡囊中进行。泡囊的固氮功能及防氧机制与蓝细菌的异形胞相似。,
