1、糖基化改性对大豆蛋白抗原性及结构特性的影响研究布冠好 朱婷伟 陈复生 （河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001）摘要 本文以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料，在干热条件下进行美拉德反应，制取不同时间下的糖基化复合物。以 -伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标，采用间接竞争ELISA 方法测定糖基化产物的抗原性，在反应 6 d 时，糖基化产物中 -伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了 31.94%和 21.26%。糖基化产物颜色加深，且游离氨基含量降低，说明大豆蛋白与糖发生了不同程度的反应。红外光谱中糖链的引入，使蛋白质分子展开，-转角和无规则卷曲结构含量降低，影响了 -伴大豆球蛋白
2、亚基的抗原表位，从而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应影响抗原性的关键作用在于蛋白与糖结合部位对蛋白质结构变化的影响。关键词 大豆分离蛋白 葡聚糖 糖基化 抗原性 结构中图分类号：TS21 文献标识码：A Effects of glycation modification on soybean protein antigenicity and structural propertiesGuanhao Bu, Tingwei Zhu, Fusheng Chen*College of Food Science and Technology, Henan University of Techno
3、logy, Zhengzhou 450001, ChinaAbstract Soy protein isolate (SPI) and dextran were used as raw materials and SPI-dextran conjugate were prepared under dry-heated at different times through Maillard reaction in this paper. The antigen inhibition rate of -conglycinin and glycinin in SPI-dextran conjugat
4、e were tested with indirect competitive ELISA method. The antigenicity of -conglycinin and glycinin decreased 31.94% and 21.26% respectively when the reaction processed at 6 days. Meanwhile, the color deepened and the free amino group content reduced which indicated that different degrees of reactio
5、n occurred between soy protein isolate with dextran. FTIR indicated that the protein structure of glycated samples unfolded as the introduced sugar chains. The reduced -corner and random coil structure content impacted the epitope of -conglycinin antigen in soybean protein, and then reduced the anti
6、genicity of soybean protein. These showed that the key effect relies on the structure changes caused by the binding site between protein and saccharide.基金项目：国家自然科学基金项目（31201293）；国家 863 项目（2013AA102208-5）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（14B550013 ）收稿日期：2015-6-作者简介：布冠好，女，1980 年出生，博士，副教授，研究方向为食品蛋白质资源开发与利用。通讯作者：陈复生，男，
7、1963 年出生，博士，教授，博士生导师，研究方向为食品蛋白质资源开发与利用。Keywords Soybean protein isolate, Dextran, Glycation, Antigenicity, Structures大豆作为一种优质的植物蛋白来源，被广泛应用于食品以及饲料工业中。大豆中的蛋白质营养价值高且价格相对廉价，但大豆蛋白也是常见的 8 大食物蛋白过敏原之一。大豆分离蛋白（SPI）是一种蛋白质含量不低于 90%的大豆产品，其主要成分包括大豆球蛋白与 -伴大豆球蛋白 1。- 伴大豆球蛋白是 7S 的主要组成，是由 3 个亚基 （67 ku）、（71 ku）、（50 ku）
8、组成的三聚体 2。大豆球蛋白作为 11S 的主要组分，是一个六聚体蛋白质，每个亚基单位均含有一个酸性链和碱性链，并通过二硫键连接 3。二者亦是大豆过敏原中两种主要的过敏原，与大豆蛋白的结构特性有密切的关系 4。在降低蛋白质过敏性试验中，已有相关研究证实糖基化反应能有效降低蛋白质的抗原性。本文以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料进行干法糖基化反应。分别以 -伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标，采用间接竞争 ELISA 方法测定糖基化复合物抗原性的变化。通过颜色测定、游离氨基含量的测定、SDS-PAGE 电泳以及傅里叶红外光谱等方法测定糖基化反应程度和蛋白结构的变化。分析大豆蛋白糖基化产物的抗原性与
9、结构之间的变化关系，为探究糖基化修饰对抗原性影响的作用机理、开发低敏性大豆蛋白制品提供理论参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器大豆分离蛋白（SPI，蛋白质质量分数 92.46%）：山东谷神生物科技集团有限公司；葡聚糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；-伴大豆球蛋白（-conglycinin，C5868 ），大豆球蛋白（ glycinin，G3171 ），酶标二抗（HRP 标记的羊抗兔 IgG，A6154），2,4,6-三硝基苯磺酸（P2297-10ML ）：Sigma 公司；兔抗 -conglycinin 血清，兔抗 glycinin 血清：实验室自制；牛血清蛋白（BSA ），TMB 单组份显
10、色液：北京索莱宝科技有限公司；低分子质量标准蛋白：中国科学院上海生物化学研究所；其他试剂均为分析纯。TGJ-18 型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；LRH-150F 型恒温生化培养箱：上海一恒科技有限公司；FC 型酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司； 96 孔酶标板：Corning Costar 公司；电泳设备：北京六一实验设备有限公司；CR-400彩色色差计：Konica Minolta 公司；Cary Eclipse 型荧光分光光度计：Varian 公司；WQF-510 型傅里叶红外光谱：北京瑞丽分析仪器有限公司。1.2 试验方法1.2.1 大豆分离蛋白-葡聚糖复合物的制备将大豆分离蛋白和葡聚
11、糖按质量比 3:1 溶解于蒸馏水中，使最终溶液浓度为 6%，混合均匀后进行真空冷冻干燥。取冻干的样品置于铝盒内，并将其放入干燥器内，以饱和 KBr 溶液来保持 79%的相对湿度，然后将干燥器置于恒温培养箱内，在 60 下制取不同反应时间的大豆分离蛋白-葡聚糖复合物。1.2.2 糖基化产物抗原性测定采用间接竞争 ELISA 方法来测定糖基化产物的抗原性，参考文献 5。分别用 0.3 g/mL-conglycinin 和 0.025 g/mLglycinin 标准抗原包被 96 孔酶标板，每孔 100 L，同时分别将 1:3200 稀释度的抗 -conglycinin 兔血清和抗 glycinin
12、兔血清与蛋白浓度为 2 mg/mL 的糖基化样品液等体积加入离心管中，混匀；4 冰箱过夜。次日甩去孔内液体，PBST（10 mmol/L，pH7.40 的磷酸盐缓冲液PBS+0.05%Tween-20）洗涤四次，每次 3 min，用吸水纸拍干；加 100 L/孔封闭液（PBS+1%BSA+0.1%Tween-20）进行封闭，37 孵育 1 h 后，PBST 洗涤4 次，拍干；抗原抗体反应：将离心管中混合液加入酶标板孔内，每孔 100 L，在 37 孵育 1 h 后，PBST 洗涤 4 次，拍干；加入 1:10000 稀释度的酶标二抗，每孔 100 L，在 37 孵育 1 h 后，PBST 洗涤
13、 4 次，拍干；然后加入TMB 单组份显色液，每孔 100 L，37 显色 10 min 后，每孔加入 50 L 2 mol/LH2SO4 终止反应。利用酶标仪双波长测定各孔的 OD 值，实际 OD 值=OD450-OD620。抗原性的大小用抑制率来表示，抑制率表示样品中抗原抑制兔抗血清与酶标板上包被的标准抗原结合能力的大小，可记为抗原抑制率；抑制率越低，则样品的抗原性越低，二者呈正比关系；计算公式如下：抗原抑制率（%）=（1-OD/OD 0）100其中：OD 表示被测样品的吸光值，OD 0 为无竞争体系的吸光值。1.2.3 糖基化产物颜色测定用 CR-400 彩色色差计来测定不同时间下糖基化
14、产物的颜色，以 L，a，b三个指标来表示糖基化产物的色泽。其中 L（0100 ，黑白）表示明度；a （-a+a，绿 红）和 b（-b+b，蓝 黄）为色品指数。1.2.4 游离氨基含量测定采用三硝基苯磺酸（TNBS）法 6对糖基化产物中游离氨基含量进行测定。用 1%SDS 溶解糖基化产物，使复合物中蛋白质的最终浓度为 5 mg/mL。取 0.25 mL 的样品液并加入 2 mL 磷酸缓冲溶液和 2 mL0.1%的 TNBS 溶液，混合均匀后在 50 下避光放置 60 min，最后加入 4 mL 0.1 mol/L 的 HCl 终止反应。避光放置 30 min 后于 420 nm 下测其吸光值。1
15、.2.5 SDS-PAGE 分析糖基化产物用蒸馏水溶解，使最终蛋白质浓度为 2 mg/mL，采用 12%的分离胶，4% 的浓缩胶进行不连续的凝胶电泳。其中上样量为 10 L，电泳全过程采用恒流，开始电泳时调节电流至 25 mA，当溴酚蓝指示剂前沿进入到分离胶时将电流调至 40 mA（约 50 min）。电泳完成后（约 2 h），将凝胶取出固定 1 h，分别用考马斯亮蓝染色，最后脱色至蛋白质条带清晰。1.2.6 红外光谱扫描将糖基化样品与干燥的溴化钾以 1:100 混合，用研钵均匀研成粉末，压成薄片后，用傅立叶红外分光光度计作全波段（4000400 cm-1）扫描，扫描 32次。利用 Peakf
16、it4.20 软件分析蛋白质的二级结构的变化。1.2.7 数据分析所有试验测定重复三次，用 SPSS 16.0 软件进行显著性分析。利用 Peak fit4.20 软件计算蛋白质二级结构含量。2 结果与讨论2.1 糖基化产物抗原性变化分析抗原性的大小可用抗原抑制率来表示，不同时间下的大豆分离蛋白-葡聚糖复合物的抗原性变化如图 1 所示。图 1 不同时间下糖基化产物的抗原性变化注：相对湿度为 79%，反应时间为 55，蛋白与糖质量比为 3:1。从图 1 可以看出，随糖基化反应时间的延长，糖基化产物的抗原性逐渐降低。反应 6 d 后，伴大豆球蛋白抗原抑制率和大豆球蛋白抗原抑制率分别为57.33%和
17、 73.29%；分别降低了 31.94%和 21.26%。说明糖基化处理能起到降低大豆蛋白抗原性的作用。引入糖链对抗原表位的掩蔽作用以及加热过程中蛋白结构的变化，二者可影响糖基化产物的抗原性变化 7。糖基化反应过程中，蛋白-糖或蛋白 -蛋白之间的相互作用影响蛋白质的空间结构，对抗原表位进行掩蔽，从而降低了大豆蛋白的抗原性 8。另一方面，伴大豆球蛋白本身是一种糖蛋白，而大豆球蛋白是一种不含糖基的六聚体蛋白质，且热稳定性相对较高，当对大豆分离蛋白进行干热糖基化处理后，伴大豆球蛋白组分受到影响大，因此，糖基化产物中的伴大豆球蛋白抗原抑制率降低效果比较明显。有研究表明，美拉德反应所得到的产物中糖与蛋白
18、结合形式稳定，遮掩抗原蛋白的抗原表位后经消化酶水解并没有再次暴露，糖基化反应确为一种有效去除大豆抗原蛋白免疫原性的方法 9。2.2 颜色测定结果分析美拉德反应在进行过程中会产生很多具有特征亮色的物质，色泽变化明显，而且在一定的条件下，可以产生不同的特征颜色物质，如：橘黄色、黄色、蓝色以及红色产物等 10。试验中不同时间下样品颜色的变化如表 1 所示。表 1 糖基化产物的色差分析结果样品 L a b0 d 78.110.02a 1.290.03j 14.710.17h1 d 77.640.36b 1.840.07i 16.760.24g2 d 77.020.53c 2.620.02h 19.30
19、0.03f3 d 76.210.05d 3.580.06g 20.880.05e4 d 75.590.07e 4.180.06f 21.800.05d5 d 74.680.04f 4.740.11e 21.890.08d6 d 74.370.05f 5.120.05d 22.060.03d7 d 73.990.16g 5.600.16c 22.620.03c8 d 73.330.06h 6.000.03b 22.980.03bc9 d 72.870.07i 6.410.05a 23.250.05ab10 d 72.790.13i 6.460.02a 23.780.06a注： a-j 表示三次试
20、验的平均值标准差，同一列中不同字母表示差异显著 (P 0.05)。从表 1 可以看到，随反应时间的增加，L 值呈下降趋势， a 值和 b 值均随反应时间的延长呈上升的趋势。a 值代表红色，正值越大说明样品颜色偏红，b 值增大，说明样品颜色偏黄。整体上产物的颜色开始由红黄色逐渐变为红褐色。产物颜色的变化情况间接反映美拉德反应的进程。类黑精等高分子物质的产生是颜色变化的主要原因 10-11，反应时间越长，褐变程度加深。2.3 糖基化产物游离氨基含量分析糖基化反应的进程也可以通过测定反应过程中游离氨基含量的变化来证实。a bcde ef efg efgfg fg g0.00.20.40.60.81.
21、01.21.40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10反 应 时 间 （ d）游离氨基含量（mmol/L）图 2 不同反应时间下糖基化产物游离氨基含量的变化注： a-g 表示三次试验的平均值标准差，不同字母表示差异显著(P 0.05) 。由图 2 可以看出，反应时间的长短对大豆分离蛋白-葡聚糖复合物的影响显著（P0.05）。随着糖基化反应时间的延长，游离氨基残留量逐渐减少，表明发生了糖基化反应。在糖基化反应过程中，蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基与糖分子中的还原末端的羟基发生了羟胺反应，因此，蛋白质中的游离氨基含量会降低 12。大豆分离蛋白-葡聚糖复合物在反应的前 5 天，时间对反应进程的
22、影响显著（P0.05），游离氨基含量下降速度很快，表明在一定的温度、湿度下大豆蛋白与葡聚糖之间发生了交联，糖基化程度加深。2.4 SDS-PAGE 分析大豆分离蛋白-葡聚糖糖基化产物的 SDS-PAGE 电泳图谱如图 3 所示。图 3 不同反应时间下糖基化产物 SDS-PAGE 电泳图注：泳道从左到右依次为 MW，低分子量标准蛋白；大豆分离蛋白与葡聚糖在质量比3:1，温度 60 ，相对湿度 79%下反应不同时间：0 d，反应 0 d；1 d，反应 1 d；3 d，反应 3 d；5 d，反应 5 d；7 d，反应 7 d；10 d，反应 10 d。A：酸性亚基；B：碱性亚基。图 3 显示，随着糖
23、基化反应时间的延长，电泳图中分离胶的顶端，电泳条带的颜色加深，即有大分子的聚合物生成。糖链的引入使得与蛋白质发生交联，反应过程中形成异肽键或二硫键，生成了一些大分子物质 13。其次，随反应时间的增加，电泳条带有轻微的上移，迁移速率变慢。可见，各个分子质量的蛋白质分子均参与了糖基化反应。此外，随反应时间的增加，7S 各蛋白亚基条带减弱，可见大豆蛋白中 7S 组分的反应程度较高。糖基化产物抗原性变化测定发现，糖基化产物中伴大豆球蛋白抗原抑制率降低效果明显，说明糖基化反应对7S 组分影响较大，通过电泳图印证了这一结果。2.5 红外光谱分析红外光谱是研究蛋白质-糖类体系很好的方法之一，因为在红外光谱中
24、特殊辨别的区域中，蛋白质和碳水化合物不存在交叉重叠 14。大豆蛋白糖基化产物的红外图谱如图 4 所示。图 4 糖基化复合物的红外扫描图谱从图 4 可以看出，与大豆分离蛋白相比，当蛋白质共价结合糖分子后，蛋白质分子中的羟基增加，在红外图谱上表现为 31003500 cm-1 区间的吸收峰变宽，另外，共价交联形成新的 N-H 键导致吸收峰的强度增大，键长缩短，伸缩振动波数升高 15。1500 cm-1 左右处的吸收峰变宽，此处的吸收峰属于 C-N 键的伸展，蛋白与多糖反应过程中，出现了新的共价键基团 14,16。接着利用 Peak fit软件对糖基化产物的酰胺带进行去卷积二阶导数拟合来计算蛋白二级
25、结构含量的变化，糖基化样品的二级结构含量变化如表 2 所示。从表 2 可得，经过糖基化改性后，复合物中蛋白质的 -螺旋、- 转角、无序结构含量减少，同时 -折叠结构含量增加。通常情况下，蛋白质二级结构中的 -折叠通常埋藏在多肽链的内部，而糖基化反应的发生，蛋白质中分子间氢键遭到破坏，减弱了蛋白质分子间的相互作用力，引起蛋白质分子结构改变 15；另一方面，糖链引入到蛋白质肽链中，而糖链的空间效应引起了 -折叠结构和无规则结构的变化，交联的糖蛋白导致蛋白质分子的变化，空间结构展开 17。单晓红 18对大豆蛋白序列的二级结构进行分析发现，-转角和无规则卷曲结构在蛋白质序列中的前段有较高频率的出现，而
26、推测出 -伴大豆球蛋白的 亚基的抗原表位集中在蛋白质序列的前段，-转角是凸出结构而且大都出现在蛋白抗原的表面，与抗体结合后很可能形成抗原表位。通过红外光谱分析发现糖基化产物中 -转角和无规则卷曲结构含量降低。由此推断，由于糖链的引入，使蛋白质分子展开，空间结构产生变化，-转角结构和无规则卷曲结构的含量下降，从而使大豆蛋白的抗原性降低。可见糖与蛋白的结合部位对蛋白质结构变化的影响使蛋白质抗原性发生改变。表 2 糖基化产物中蛋白质的二级结构含量二级结构 (%)样品-螺旋 -折叠 -转角 无序结构0 d 13.27 35.52 39.10 13.651 d 12.45 39.32 35.48 12.
27、742 d 12.52 38.81 35.85 12.813 d 12.84 36.52 38.10 12.544 d 12.95 38.45 36.23 12.315 d 12.85 36.19 38.35 12.616 d 12.61 39.74 34.59 13.057 d 12.77 36.72 37.89 12.618 d 12.96 42.16 33.00 12.509 d 12.88 37.48 36.95 12.4610 d 12.83 36.82 37.80 12.553 结论大豆分离蛋白-葡聚糖复合物抗原性随反应时间的增加而整体上呈降低的趋势。在反应 6 d 时，糖基化产物
28、中 -伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了 31.94%和 21.26%。反应过程中，伴大豆球蛋白受影响较大，抗原抑制率降低效果明显。随着反应时间的增加，糖基化产物颜色变化明显，且游离氨基含量逐渐降低。SDS-PAGE 图中电泳条带的变化说明大分子物质的生成以及7S 组分反应程度较高。 红外光谱扫描发现，糖链的引入，使蛋白质分子展开，结构中 -转角和无规则卷曲结构含量降低，影响了大豆蛋白中 -伴大豆球蛋白的 亚基的抗原表位，从而使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应对抗原性影响的关键作用在于糖与蛋白的结合部位对蛋白质结构变化的影响。参考文献1 Moriyama T, Kishimoto K,
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