1、第八章 菌种的保藏,第一节 菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退二、菌种的复壮第二节 菌种的保藏一、菌种保藏的目的二、菌种保藏的原理三、菌种保藏的方法,性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡,第一节 菌种的衰退和复壮,在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰
2、退或使已衰退的菌种得以复壮。,一、菌种的衰退,菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,纯菌种,自发突变,突变个体,传代增殖,原始个体,不纯菌种,衰退菌种,（一）菌种衰退的现象,菌落和细胞形态改变生长速度缓慢，产孢子越来越少代谢产物生产能力下降，即出现负突变致病菌对宿主侵染能力下降对外界不良条件的抵抗能力下降等,（二）菌种衰退的原因,基因突变主要原因1、有关基因发生负突变导致菌种衰退2、表型延迟造成菌种衰退3、质粒脱落导致菌种衰退连续传代加速衰退不适宜的培养和保藏条件加速衰退,（三）菌种衰退的防止,控制传代次数创造良好的
3、培养条件利用不易衰退的细胞移种传代采用有效的菌种保藏方法讲究菌种选育技术定期进行分离纯化,二、菌种的复壮,狭义的复壮消极的措施是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。,广义的复壮积极的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。,菌种复壮的主要方法,纯种分离法,菌落纯（“菌种纯”）,细胞纯（“菌株纯”）,通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原
4、菌株的典型性状。,宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。,淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。,遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。,第二节 菌种的保藏,菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。,一、菌种保藏的目的,菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死 亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、 交换和使用等诸方面的需要。,二、菌种保藏的原理,首先应该挑选典型菌种的
5、优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。,其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。,尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,三、菌种保藏方法,各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。,斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法,（一）斜面低温保藏法常用保藏法,将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生
6、长完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。,（二）石蜡油封藏法,此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内保藏。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用
7、于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存12年左右。,（三）砂土管保藏法,一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。,砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约110年。,该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌11.5h，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空
8、约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。,（四）麸皮保藏法,又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。,此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较多采用。,（五）甘油悬液保藏法,此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低
9、温冰箱。保藏温度若采用20，保藏期约为0.51年，而采用70，保藏期可达10年。,将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在1015，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。,（六）冷冻真空干燥保藏法,又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。,此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低
10、温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。,（七）液氮超低温保藏法,简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（196）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。,此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各
11、种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。,（八）宿主保藏法,此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。,植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。,在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。,美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和液
12、氮保藏法来保藏所有菌种。,我国CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。,ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图,； http:/www.zgkss.top/ 看守所 cth58dwc 涸、泪渐干？洛月躲在屋里，手心冒汗。她遵照 的意思，取闺房中现成的红染料浸出水，趁人看不见打进泥土中，芙蓉树吸了，汁液中便流着红色，又从断口中渗出来。洛月在做这事时，只以为吓唬吓唬那些敢挖树的人，没想到会惊动到老太太，闹得这么大。老太太看过了那些“血泪”，甚至闻了闻，问嘉颜：“留了么？”嘉颜道：“留了一份，送到外头验了。”老太太道：“快把树请回土里去，好生照料着。”众人应着。老太太进
13、宝音屋里来。宝音倚在床边，长发在颈后以丝巾束住，简洁柔婉，纤细双肩披袭淡色长衣，见老太太进来，忙叫乐韵扶她行礼。老太太叫止了。嘉颜不听，在地上行了大礼，依次对大太太二太太也施礼毕，呜咽：“惊动这么多长辈，毓笙心下惭愧死了。”第二十四章 芙蓉泣血移宝屋（2）“糊涂孩子，”老太太看着乐韵把 扶回床上坐着，“那树有异常，又关你什么事？”宝音道：“总是毓笙院子里出的事”老太太听宝音说话，不带咳喘，气息撑得下来，虽还娇弱，遣词行句倒比从前还得体了些，再仔细看她脸上，气色也见好些，眸光温润内敛，更非从前那恹恹抱恙的目光，不由惊奇道：“笙儿，你身体见好？”宝音答道：“多托外婆的福，多亏大舅母、二舅母关心照料
14、，自从用了于大夫新药之后，笙儿自己觉得是一天天爽利起来。”老太太又问：“昨天晚上，可惊着你了不成？”宝音便有些迟疑：“笙儿一早起来，听丫头们讲说，半夜有什么声音还觉奇怪呢，怎么笙儿似乎没听着什么。”老太太便问丫头：“昨晚你们听见什么？”乐韵对答如流：“是听见怪声，像有人哭，婢子惊醒回来，看姑娘睡得熟熟的，不敢惊动。幸好那怪声持续时间不长，很快就止息了。早上，听其他人也说这事，不是婢子一个人错听，这才不敢瞒了，便照实禀报了姑娘。”老太太抚摸着宝音的手：“可怜见的。”宝音的手温暖，不湿、不燥。老太太很欣慰，这是一双健康的手。若真有恶鬼闹事，屋主人怎还会如此健康？老太太放心多了，宝音看着老太太，一脸依恋和求助：“外婆，其实，昨晚”又不敢说下去。老太太鼓励她：“昨晚怎么了？说呀？”宝音悄悄抬起一点眼皮，又不敢说。老太太便命大太太二太太：“没什么事了，你们先回罢。我这儿同孩子说会儿话。”大太太二太太便告退，并乐韵都送客出去了，屋里只剩下老太太和宝音。老太太道：“好孩子，有什么话，你信得过外婆，但说出来，不妨事！”宝音感戴道：“这事，笙儿想来想去，也只有同外婆讲，人家说不定怎么笑话我呢！外婆一直明达，想必不会斥责笙儿。”“绝不会斥责的。”老太太答应她，“你讲罢！”宝音道：“其实昨晚，笙儿做了个梦，有人青裙粉帔，似乎是极,
