1、- 1 -冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型1.1 实验材料1.1.1 实验动物 清洁级 Wistar 近交系大鼠 100 只(购自中国科学院上海实验动物中心)，均为雄性，体重 245320g(平均 278.222.2g)，饲养环境为清洁级。1.1.2 试剂 3%戊巴比妥钠，1%肝素钠，Evans 蓝和 N-BT 磷酸缓冲液(Sigma 公司)。1.1.3 实验仪器 心电图机，动物呼吸机(浙江医科大学医疗仪器设备厂， DH150 型动物呼吸机)，Buxco 系统 (Buxco 公司)。1.2 模型制作1.2.1 动物分组 根据研究目的，实验动物共分六组；其中五个组需手术制作模型，合称手术组，另一个
2、组为假手术组。为满足每组 12 只的要求，先后有 100 只动物随机进入手术组(85 只) 与假手术组(15 只) 。1.2.2 制作方法1.2.2.1 手术组 用 3%戊巴比妥钠(30mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉满意后置于手术台，四肢及头部仰卧固定于手术台上，四肢皮下连接心电图电极，记录标准导联心电图，颈部皮肤备皮消毒，胸骨上窝上正中切开皮肤 0.5cm，向上钝性分离推开下颌下腺，剪除气管前肌肉，使气管在没有任何拉钩牵引的情况下能充分显露，彻底止血后于第 23 气管环间行气管横行切开，注意不要切断气管软骨环，切口长度不超过气管周径的 1/3，擦干其内分泌物后插入气管插管 (用小儿吸痰管自
3、制)，深度为 0.51cm。连接空气呼吸机进行人工控制呼吸，呼吸频率 90 次/ 分，潮气量1012ml，吸呼比设为 11。左前胸去毛，消毒铺巾，顺肋间隙方向于胸骨左旁第34 肋间切开皮肤，长约 1cm，逐层分离皮下组织、肌肉，于 23 肋骨间撑开进胸，向右上方推开胸腺，可暴露心脏及大血管根部，切开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，有部分动物在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部，用 6-0Prolene 线缝针，进针深度控制在 0.1cm，宽度为 0.10.2cm( 图 1)；回纳心脏入胸廓，待动物的数十次心动周期后，收线打结；观察数分钟后，彻底止血后逐层关胸。关胸过程中于切口内
4、放置排气管(用小儿头皮针的软管自制)，关胸毕，抽空胸腔积气后拨除。恢复大鼠自主呼吸，拨出气管内插管，清除气管内分泌物，气管切口及颈部切口开放，不作缝合。手术过程中分开胸后、缝针后、结扎后和关胸后四个点记录心电图变化；合格动物 2 周及 6 周后均复查心电图。以上手术均在严格无菌条件下进行。术后肌肉注射青霉素钠 20 万单位/d ，连续 5 天抗感染。1.2.2.2 假手术组 仅在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠脉前降支位置取同样大小的针缝针而不打结，余操作与手术组同。1.3 心功能检测 模型制作 6 周后(干预治疗 4 周后 )，再次 3%戊巴比妥 30mg/kg 腹腔内注射麻醉。原切口进胸，分离
5、粘连，显露心尖，将含肝素液导管自心尖向心底方向插入左心室腔内，导管另一头连接于压力换能器，导入 Buxco 系统描记左心室压力(LVP) 曲线，测得左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP) ，同时将LVP 电信号同步输入微分器，描记曲线，测得左心室等容收缩期室内压最大上升速率(+dp/dt max)、左心室等容舒张期室内压最大下降速率(-dp/dt max)。1.4 心梗面积的计算 除模型评估亚组动物全部计算心梗面积外，余各亚组及假手术组各取 4 只计算面积。心功能检测毕，自左室导管注入 10%氯化钾 1ml，使心脏停止在舒张期，再以 5%的 Evans 蓝 2ml 注入，以区分
6、心肌的心梗区(不染色)和非心- 2 -梗区，立刻剪下心脏，用生理盐水灌洗，并除去心房与右室组织，称重。与左室长轴垂直作连续切片，每隔 2mm 一张；放入 0.1%的 N-BT 磷酸缓冲液(pH7.4)37水浴 30min，梗死心肌细胞中脱氢酶因细胞膜损伤而完全释放而丢失，不能使 N-BT还原染色，因而梗死心肌不被染色，残余存活心肌则被染成蓝色(图 2)。染色后再用生理盐水冲洗，将未着色的缺血(缺血)区域小心切下，并称湿重。用以下公式计算缺血心肌占全心重量的百分比：心肌梗死范围(%)(未着色缺血区域湿重/ 全心湿重)100%。1.5 统计学方法 数值变量以 s 表示，组间均数以 t 检验，所有计
7、算在统计软件xSPSS11.0 上进行，取 0.05。2 结果2.1 死亡率 假手术组 15 只动物，死亡 1 只，原因为失血性休克。 85 只手术组动物中在 24 小时内 11 只死亡，死亡率为 12.9%(11/85)，死亡原因有急性心衰(5 例)、失血性休克(3 例) 、呼吸衰竭、心律失常和麻醉意外(各 1 只)；另对照亚组与模型评估亚组各 2 只于实验第 45 周死亡，死亡原因为慢性心衰，这 4 只动物均纳入术后6 周心梗面计算中。2.2 合格情况 心电图以结扎前(图 3As、3Ao)为正常，以利判别，存活的 14 只假手术组动物均合格，心电图(图 3Bs)及术中肉眼观正常，任选 12
8、 只进入研究，6 周后心脏标本截面整齐均匀，无心肌变薄或颜色变化(图 4A)，2 周、6 周后心电图也无明显变化(图 3Cs、Ds)；74 只存活的手术组动物的合格标准为：术中见结扎后肉眼观有明确的、一定范围的结扎线远端心肌活动度减弱或消失，心肌颜色变暗；120min 后出现不同程度的心电图肢导联 ST 段弓背向上抬高，无或仅有短暂的心律失常(图 4D)；脱机后，呼吸平稳，不需再次呼吸机辅助者。合格动物达到 60只后，不再制作模型，故模型合格率为 81.1%(60/74)。所有进入实验的动物 2 周后均再次开胸并复查心电图，合格动物 2 周后复查心电图表现有ST 段弓背向上抬高；QRS 波群幅
9、度降低；ST 段低平等；无一例出现心律失常 (图 4Co)。肉眼观为左室前外侧壁可见椭圆形、不规则形心肌变白区，估计占左室面积的 1/31/2 不等，变白区心肌活动减弱或消失，甚至有反常运动。手术组中的模型评估亚组中的 6 只大鼠此时处死，其心脏可见左室前外侧壁明显变薄，心肌横截面可约占左室周径 1/3的左室前外侧壁明显变薄(图 4B)。假手术组动物 2 周时心电图无明显变化，肉眼观大致正常。手术组动物胸腔内粘连与假手术组相似，但有 6 例伴胸水，而假手术组无胸水。术后 6 周再次开胸并复查心电图，假手术组心电图与肉眼观基本同前；手术组动物心电图与 4 周前相比无明显变化(图 3Do)，但肉眼
10、观有不同程度的心肌变白区的扩大，以模型评估亚组和对照组更为明显(图 4C)。2.3 心功能检测 本文列举假手术组与手术组中的对照亚组、模型评估亚组的测得值(表 1)，手术组中有 4 只动物于第 45 周死亡。表 1：心功能比较(tab 1: Compare of heart function)心功能(Heart function)例数(cases) LVSP LVEDP +dp/dtmax -dp/dtmax假手术组(sham operation group) 12 113.313.3 -1.28.4 5819.5911.6 4408.4409.7- 3 -手术组(operation grou
11、p) 20 88.110.0 11.66.8 3744.8530.7 2941.9516.4各(all)P0.0002.4 心梗面积 手术组中模型评估亚组术后 2 周时 6 只动物的心梗面积为(34.46.0)%(22.8%44.7%)，而对照亚组 (随机取 2 只加上术后第 4 周死亡的 2 只)和模型评估亚组术后 6 周时(含第 5 周死亡 2 只的另 6 只)10 只动物的是(45.76.6)%(37.4% 56.0%)；6 周时面积明显大于 2 周时面积(P0.004)。2.5 组织病理学检查 假手术组动物心脏三层结构清晰，心肌纤维排列整齐，未见断裂，变性及坏死；间质内未见炎细胞浸润；
12、心内膜，心外膜亦未见异常改变(图5A)。2 周时，手术组的模型评估亚组 6 只动物心脏左室前壁及心尖部心肌厚层或全层梗死，近心外膜心肌梗死更重，梗死区心壁变薄；心梗区内的坏死心肌组织大部份被溶解吸收，被增生的肉芽组织所替代，其间可见散在分布呈岛状或细带状的存活心肌组织(常间断联成片)，梗死区心肌纤维红染，间隙增宽，横纹消失，核固缩或溶解；梗死区边缘可见充血，出血带及不等量中性粒细胞浸润；梗死区心外膜表面可见渗出的不等量纤维素，中性粒细胞及漏出的红细胞；内膜光滑，未见附壁血栓形成(图 5B)。6 周时，心梗区镜下基本全部是纤维母细胞和纤维细胞以及致密的胶原纤维束，呈束状或平行状排列，胶原纤维束之
13、间几无残存的存活心肌组织，炎性细胞浸润已少见(图 5C)。3 讨论制作充血性心力衰竭动物模型的病理机制包括压力超负荷、容量超负荷、心肌收缩力下降等。心肌缺血造成心肌细胞数目减少、心肌收缩力下降，其动物模型主要用于心肌缺血后的病理生理变化、新的治疗方法的实验研究；多种动物可用于模型制作, 如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、犬、羊等；猪及犬个体较大,操作及观察较为容易, 但价格较贵, 因此所以许多研究者更倾向于选用个体适中, 价格相对便宜的大鼠，大鼠中常可选用Sprauge-Dawley大鼠及Wistar大鼠。冠状动脉结扎法和左室液氮冷冻法是大鼠动物模型的常用制作方法，均可造成左室心肌的缺血坏死，前者主
14、要是通过狭窄或闭塞冠状动脉造成心肌缺血和梗塞, 致心肌收缩力下降引起心力衰竭，最大的优点为临床相关性好，但受多种因素的影响，心梗区面积不易控制，位置常变化，动物模型之间的变异大，心功能检测易出现多变性；而冻伤模型中梗死造成的瘢痕组织位置相对固定，瘢痕的面积大小也相对恒定，心功能测定时动物变异小，但临床相关性差。鉴于两种模型各有的优缺点，而我们的干细胞转基因治疗冠心病的实验研究设计侧重于最大限度地模拟临床，故选用前者。结扎左冠状动脉法上世纪50年代己基本成熟 1，效果确切，当心肌梗塞面积超过20% 时就可出现明显的心衰 2。模型间的齐同性、稳定性和降低动物的死亡率是造模的关键，结扎大鼠左冠状动脉
15、, 随结扎部位的高低可造成面积大小不等的心肌梗死，因此精确的操作步骤，并力争在同一高度确切结扎是保持模型的稳定性的关键，也是降低动物死亡率的关键；经解剖死亡动物及淘汰动物(处死后先取骨髓细胞)，可以发现大鼠左冠状动脉主干短，自左冠状窦发出后立刻分为回旋支与左前降支，左前降支起于左心耳与肺动脉圆锥间，走行于前室间沟的以外膜深面，供应左室前外侧壁大部与室间隔前部，从心表面观察，大部分动物的左前降支肉眼无法辨认。因此在模型制作的过程中，应以左心耳的下缘为标记，如图1所示，平左心耳的前下角进针，向右缝0.10.2cm以跨越前室间沟缝扎前降支，进针深度0.1cm已足够，且不易形成心脏的穿透性损伤；为保证
16、手术操作的精确度，必须有良好的手术视野，自第23肋间与身体纵轴线成45度角撑开，向上方推开胸腺后，可满意显示左心耳- 4 -与肺动脉圆锥，挤出心脏后可方便地在左心耳与肺动脉圆锥间缝针，如果心脏出血，切忌盲目钳夹，以造成更大的损伤，此时可以干纱布压迫出血点，如压迫准确，力度适当，大多数情况下可以止血。缝针的要点是动作准确，力争一次成功，尽管有学者 3认为如一次结扎不成功，可再次或多次结扎；但我们认为重复缝扎必然束缚更多的心肌组织，加重心肌损伤，除有可能导致心律失常或失血过多，造成动物死亡外，反复操作造成的机械性损伤与心肌细胞的缺血性损伤是有不同的病理转归的，可能会影响模型的稳定性，导致实验结果的
17、偏差。即便是动物存活，其胸腔内粘连可能较重，不利于再次手术(本实验共三次手术)。麻醉与呼吸管理也是影响动物死亡率的因素，我们的麻醉剂量较低，动物进入麻醉状态的时间相对较长，但术后复苏快；气管切开、人工呼吸的方法操作虽较容易、安全，但术后呼吸道并发症多,有呼吸道分泌物多，堵塞气道之虞，我们的对策是剪除气管前肌群，充分敞开切口，撤机后仔细清除气道内残余分泌物。我们的85只手术组动物中24小时内死亡11只，死亡率为12.9%(11/85)，合格动物 60只，模型合格率为 81.1%(60/74)，总有效使用率为70.6%(60/85)，高于朱彤莹等 4和边长勇等 3分别报道的53.8%和60%的存活
18、率，而且存活动物无一例心律失常，可能与我们强调一次缝扎、低剂量麻醉和呼吸道护理有关。本实验中淘汰动物的原因是缝扎位置过低或偏离前室间沟，造成缺血范围偏差。尽管淘汰14只动物后，术后2周的心梗面积仍波动于22.8%44.7%，6周时波动于37.4% 56.0%之间；因此，标本数量要偏大，以减少模型间的差异给实验结果造成的不利影响。本实验的结果还表明：冠脉结扎后，大鼠 6 周时心梗面积较 2 周时明显增加，与液氮冷冻后心梗面积可继续扩大至术后 48 周的结果相符 5；心电图变化与临床相似。提示大鼠心梗后同样也经历与临床接近的心室重构过程，心梗模型能较好地反应临床的病理过程；但同时要注意到人冠脉管壁
19、增龄变化显著，大鼠冠脉无明显增龄变化，二者间种属差异较显著 6，这种比较解剖学上的差异，又提示用动物实验研究结果解释人类某些机理时需持慎重态度。参 考 文 献1. Johns T, Olson B. Experimental myocardial infarction: A method of coronary occlusion in small animalsJ. Ann Surg, 1954,140(4):675-682.2. Xu D, Martin P, Ohara M, et al. Upregulation of Aquaporin-2 Water Channel Express
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