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胰岛素生产流程图.pptx

上传人:weiwoduzun 文档编号:4083227 上传时间:2018-12-07 格式:PPTX 页数:17 大小:5.06MB
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资源描述

1、胰岛素 (E.Coli)生产流程人胰岛素 碳水化合物代谢和体细胞供能一级结构: 51个氨基酸 双链( A: 21, B: 30)分子量: 5734 g/mol等电点: 5.4胰岛素产生受损导致糖尿病人胰岛素的制备方法 人胰腺提取 -原料来源有限 通过单个氨基酸化学合成 -生产成本太高 猪胰岛素转化或 “ 半合成 ” -成本高,来源少 基因工程菌发酵-双链 Genentech,开发, Eli Lilly 放大-胰岛素原( 82个氨基酸,胰岛素的前体)-分泌法( Yeast), Novo Nordisk产业化-细胞内法( E.coli),表达 121+82个氨基酸的 Trp-LE-Met-proi

2、nsulin包涵体, Eli Lilly 产业化E.Coli胰岛素原法转化流程市场分析和设计基础( 2005) 糖尿病人数:美国 1800万,全世界 1.5-2.0亿,年增长率 3-4% 胰岛素年销售额 35-40亿美元 , 由 Novo Nordisc、 Eli Lilly和 Sanofi Aventis三家垄断 每个患者每年购买胰岛素的花费: $250-750 每个病人每年平均用量: 0.5克纯胰岛素 对 1.5-2.0亿患者,年需求 75-100吨纯胰岛素 目前年产量 20-30吨纯胰岛素 设计年产量: 1800kg纯胰岛素,满足 350万人 年工作 330天,每 48小时生产一批次,每

3、年 160批次 每批次发酵液体积: 37.5立方米, 发酵罐空罐体积: 50立方米人重组胰岛素( E.coli)生产流程 发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段通气量:0.5VVM 空罐体积: 50立方米前接 2级种子罐发酵周期: 18小时发酵温度: 37度终菌密度: 30克(干重) /升包涵体含量:干重的 20%终保温: 10度发酵工段初回收工段 物料温度保持 10度-三个平行的碟片式离心机收获菌体-菌液从 37000L浓缩到 9165L菌泥-菌体收率 98%加与菌泥等体积的缓冲液(96.4%w/w WFI注射用水 ,0.7%EDTA, 和 2.9% TRIS-base)稀释 ,有利于菌

4、体碎片与包涵体分离三次高压匀浆机破菌释放包涵体压降 800bar终物料体积:1400L用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98%加 2倍体积的清洗剂(0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体反应工段 溶解包涵体玻璃反应釜内加终浓度为 300g/L(5M)的尿素(溶解变性蛋白)和40g/L的 2-巯基乙醇(减少二硫键的结合)反应时间: 8小时溶解收率: 95%包涵体内 Trp-LE-Met-proinsulin含量 : 80% w/wWFI透析 6小时,收率 98%,去除尿素和2-巯基乙醇过滤去除细小颗粒,保护后续层析柱。终体积 5200L再次离心,去除菌体碎片和可溶性蛋白共用前面回收工

5、段的碟片离心机反应工段 嵌合蛋白被 CNBr溴化氰裂解为 121个氨基酸的 Trp-LE-Met和 82个氨基酸的 Proinsulin70%甲酸溶液30倍过量加入 CNBr(理论摩尔比 1:1)收率 95%反应时间: 12小时反应温度: 20度利用前面溶解反应釜在 CNBr沸点35度旋转真空蒸发 1小时会产生少量有毒氰化物气体,现场应准备次氯酸盐亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键,给半胱氨酸加上 SO3部分pH 9-11, 50%w/w(6M)盐酸胍, 0.35%碳酸氢铵, 3%硫酸钠, 1.5%过硫酸钠,反应时间 12小时,收率 95%WFI透析至盐酸胍浓度为20%w/w共用前面包涵体溶解过程的透析器反应工段 再折叠三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin床直径: 140cm床高度: 25cm填料: SP Sepharose FF, GE洗脱液: 29% w/w尿素,1.5%NaCl, 69.5%WFIpH4收率 90%再折叠的目的是去除SO3,然后使二硫键形成,并再折叠成胰岛素原的正确天然结构加入巯基乙醇反应工段 酶转化终纯化工段终纯化工段

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