1、胰岛素 (E.Coli)生产流程人胰岛素 碳水化合物代谢和体细胞供能一级结构： 51个氨基酸 双链（ A： 21， B： 30）分子量： 5734 g/mol等电点： 5.4胰岛素产生受损导致糖尿病人胰岛素的制备方法 人胰腺提取 -原料来源有限 通过单个氨基酸化学合成 -生产成本太高 猪胰岛素转化或 “ 半合成 ” -成本高，来源少 基因工程菌发酵-双链 Genentech,开发， Eli Lilly 放大-胰岛素原（ 82个氨基酸，胰岛素的前体）-分泌法（ Yeast）， Novo Nordisk产业化-细胞内法（ E.coli），表达 121+82个氨基酸的 Trp-LE-Met-proi
2、nsulin包涵体， Eli Lilly 产业化E.Coli胰岛素原法转化流程市场分析和设计基础（ 2005） 糖尿病人数：美国 1800万，全世界 1.5-2.0亿，年增长率 3-4% 胰岛素年销售额 35-40亿美元 , 由 Novo Nordisc、 Eli Lilly和 Sanofi Aventis三家垄断 每个患者每年购买胰岛素的花费： $250-750 每个病人每年平均用量： 0.5克纯胰岛素 对 1.5-2.0亿患者，年需求 75-100吨纯胰岛素 目前年产量 20-30吨纯胰岛素 设计年产量： 1800kg纯胰岛素，满足 350万人 年工作 330天，每 48小时生产一批次，每
3、年 160批次 每批次发酵液体积： 37.5立方米， 发酵罐空罐体积： 50立方米人重组胰岛素（ E.coli）生产流程 发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段通气量：0.5VVM 空罐体积： 50立方米前接 2级种子罐发酵周期： 18小时发酵温度： 37度终菌密度： 30克（干重） /升包涵体含量：干重的 20%终保温： 10度发酵工段初回收工段 物料温度保持 10度-三个平行的碟片式离心机收获菌体-菌液从 37000L浓缩到 9165L菌泥-菌体收率 98%加与菌泥等体积的缓冲液(96.4%w/w WFI注射用水 ,0.7%EDTA, 和 2.9% TRIS-base)稀释 ,有利于菌
4、体碎片与包涵体分离三次高压匀浆机破菌释放包涵体压降 800bar终物料体积：1400L用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98%加 2倍体积的清洗剂(0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体反应工段 溶解包涵体玻璃反应釜内加终浓度为 300g/L(5M)的尿素（溶解变性蛋白）和40g/L的 2-巯基乙醇（减少二硫键的结合）反应时间： 8小时溶解收率： 95%包涵体内 Trp-LE-Met-proinsulin含量 ： 80% w/wWFI透析 6小时，收率 98%，去除尿素和2-巯基乙醇过滤去除细小颗粒，保护后续层析柱。终体积 5200L再次离心，去除菌体碎片和可溶性蛋白共用前面回收工
5、段的碟片离心机反应工段 嵌合蛋白被 CNBr溴化氰裂解为 121个氨基酸的 Trp-LE-Met和 82个氨基酸的 Proinsulin70%甲酸溶液30倍过量加入 CNBr(理论摩尔比 1:1)收率 95%反应时间： 12小时反应温度： 20度利用前面溶解反应釜在 CNBr沸点35度旋转真空蒸发 1小时会产生少量有毒氰化物气体，现场应准备次氯酸盐亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键，给半胱氨酸加上 SO3部分pH 9-11， 50%w/w(6M)盐酸胍， 0.35%碳酸氢铵， 3%硫酸钠， 1.5%过硫酸钠，反应时间 12小时，收率 95%WFI透析至盐酸胍浓度为20%w/w共用前面包涵体溶解过程的透析器反应工段 再折叠三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin床直径： 140cm床高度： 25cm填料： SP Sepharose FF, GE洗脱液： 29% w/w尿素，1.5%NaCl, 69.5%WFIpH4收率 90%再折叠的目的是去除SO3，然后使二硫键形成，并再折叠成胰岛素原的正确天然结构加入巯基乙醇反应工段 酶转化终纯化工段终纯化工段
