1、中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断共识,2013 V1.0,中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识,目的：提高我国ALK融合基因型肺癌的个体化精准治疗能力 （precision therapy）非小细胞肺癌的个体化靶向治疗：伴随分子诊断是前提 虽然ALK融合基因阳性患者仅占NSCLC的5%，但是总体患者负荷较大，治疗需求迫切 ALK融合基因阳性NSCLC具有独特临床&病理、治疗和预后特征，已成为NSCLC中的一个分子亚型 第一个ALK抑制剂克唑替尼已获得SFDA的批准（2013.01）,中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识,总体原则 综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子分析方法的特点、
2、实验室自身条件，需要多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证ALK融合型肺癌的检出率和准确率从临床诊断角度出发，综合最新的研究数据，并结合SFDA批准的伴随诊断方法，定期更新，保证检测结果的可信性和临床实际可操作性,ALK prevalence in China,ALK阳性NSCLC总患者数约为HER2阳性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多,ALK阳性肿瘤患者34,820例,乳腺癌 HER2阳性患者49,631例,驱动突变肿瘤的每年发病数,中国肿瘤登记年报，2012,CML 10,000例左右,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群A
3、LK检测诊断流程专家共识,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识,ALK 阳性 vs EGFR突变 vs NSCLC,病因 临床&病理特征 患者预后 治疗方法,ALK vs EGFR：不同的驱动基因,ALK 融合基因驱动,EGFR突变驱动,临床&病理特征：ALK融合 vs EGFR突变,ALK阳性NSCLC与EGFR突变NSCLC,与EGFR突变患者相比，ALK阳性NSCLC患者发病年龄更轻，更偏重于男性,A T . Shaw,et al. J Clin Oncol. 2009;27:4247-4253,与EGFR突变人
4、群相比，ALK融合人群年龄更轻,ALK融合与EGFR突变NSCLC的病理类型不同,Clin Cancer Res 2009：20例发现ALK融合的肺腺癌中 82%病例的癌细胞中包含粘液成分 71%病例中，10%的肿瘤细胞中含大量粘液成分,ALK,TRIBUTE研究亚组分析：EGFR突变患者预后较好,ALK阳性NSCLC患者的预后更差,ALK 阳性 vs ALK 阴性,Yang P, et al. J Thorac Oncol. 2012;7: 9097,Years since diagnosis,PFS/RFS曲线 FISH(positive) versus FISH(negative),Ye
5、ars since diagnosis,PFS/RFS曲线 IHC3(positive) versus IHC0/1 (negative),ALK 阳性 vs EGFR突变 vs NSCLC,ALK阳性非小细胞肺癌已成为NSCLC特定的亚型,不同的驱动基因,不同的患者预后,不同的治疗方法,不同的临床&病理特征,AT. Shaw, et al. J Clin Oncol, 2009,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,专家组推荐命名：,根据专家的讨论，从检测方法学角度考虑到ALK融合型肺癌不仅是基因序列层面的改变，ALK融合蛋白也是该类疾病中的重要变异，因此将此类疾病统称为ALK阳性非小细胞
6、肺癌,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,专家组推荐定义：,ALK阳性非小细胞肺癌： 是指包括ALK FISH检测阳性、ALK序列融合变异或ALK融合蛋白表达阳性的肺癌，肿瘤细胞中存在ALK融合基因表达，是非小细胞肺癌的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识,是否需要富集人群检测ALK：EGFR突变？,EGFR与ALK双突变的存在：5%-13% EURTAC研究中：双突变概率15.8%（RT-PCR法） 有文献报道，双突变患者克唑替尼治疗有效,是否需
7、要富集人群：临床因素,如果按照临床因素富集，将漏诊33%（2/6）的ALK阳性患者,Yoshiko Murakami, et al. Frontiers in Oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024,是否需要富集人群：病理因素,如按病理因素富集：可能会遗漏30%(5/17)的ALK阳性患者,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK检测适宜人群 专家组推荐：,可优先在病理组织学特点富集的优势患者中进行ALK分子检测 但单纯依靠临床特征与病理分型选择适宜人群并不能完全包括所有的ALK阳性NSCLC患者，对于潜在怀疑存在ALK融合变异的患者均可进
8、行ALK融合基因检测,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK检测适宜人群 专家组推荐：,可优先在病理组织学特点富集的优势患者中进行ALK分子检测 但单纯依靠临床特征与病理分型选择适宜人群并不能完全包括所有的ALK阳性NSCLC患者，对于潜在怀疑存在ALK融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识,NSCLC 活检组织标本,阴性或未知；,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,Ventana IHC,常规IHC检测*,阳性,FISH,RT-PCR（qPCR、多重PCR或RACE-PC
9、R-Seq）,EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者,石蜡标本,3+/2+/1+,阴性,ALK阳性非小细胞肺癌,EGFR突变检测,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK检测流程图 专家组推荐：,适合ALK融合基因诊断的肿瘤样本，包括各种组织样本和细胞学标本。 组织标本获取手段包括手术标本、支气管镜、经皮肺穿刺、淋巴结活检、手术活检等 对于恶性胸腔积液、心包积液、痰液或支气管灌洗液、细胞学穿刺和外周血肿瘤细胞等样本，在细胞数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块（cell block），检测方法可采用FISH或IHC 如果是新鲜细胞标本可考虑采用特异性PCR方法。考虑到
10、细胞学样本的细胞数量少等特点，细胞学标本的检测结果解释需格外谨慎,NSCLC 活检组织标本,阴性或未知；,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,Ventana IHC,常规IHC检测*,阳性,FISH,RT-PCR（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）,EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者,石蜡标本,3+/2+/1+,阴性,ALK阳性非小细胞肺癌,EGFR突变检测,采用高灵敏度的检测系统后，有越来越多的数据支持使用IHC作为初步筛查 灵敏度和特异度都可达到100，但是不同研究间有差异 与FISH相比，IHC是一种更常规的技术，成本更低，且工作强度也更低,ALK
11、 IHC,FISH,患者1： IHC显示ALK强表达，FISH显示重排,患者2： IHC显示无ALK表达，FISH显示无重排,IHC用于检测ALK表达,Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 2010;16:15611571.,常规IHC的抗体选择,常规IHC敏感性高（假阴性率低），特异性低（假阳性高），因此建议IHC阳性患者（无论1+，2+，3+）均需FISH、RT-PCR、Ventana IHC确诊）,E Thunissen, et al. Virchows Arch(2012)461:245-257,常规IHC与FISH的吻合性良好,A. J.Weic
12、khardt, et al. Cancer. 2012 Dec 20. doi: 10.1002/cncr.27913,价格便宜，适合于NSCLC患者的筛选操作流程简单、易行,判读标准主观操作流程需标准化,优势,IHC（3+）与FISH（+）符合率98%,劣势,IHC（2+）与FISH（+）符合率63%,IHC（+）与FISH（+）符合率10%,IHC（-）与FISH（-）符合率100%,ALK 常规IHC与克唑替尼疗效存在相关性,E L. Kwak, et al. N Engl J Med 2010;363:1693-1703,IHC阳性，FISH阴性克唑替尼治疗有效,54岁，女性，腺癌 I
13、HC 阳性（左图） FISH阴性（右图） ROS1与cMET均阴性 Crizotinib 250mg bid 治疗有效，肿瘤PR,JM Sun, et al. J Thoracic Oncol, 2012 Case Report,IASLC/CAP/AMP，2013 肺癌分子检测指南,ALK IHC检测，如经过仔细确认，可考虑作为ALK FISH诊断前的筛选方法,NI Lindeman, et al. 2012 CAP, doi: 10.5858/arpa.2012-0720-OA,常规手动IHC注意事项及判读标准,“采用IHC法需注意以下两点。第一，由于ALK的蛋白表达与神经外胚层的分化有关
14、，故其可能在小细胞肺癌和正常人的脑组织中存在表达。因此，不建议在小细胞肺癌中使用ALK融合蛋白的IHC检测。第二，IHC的阳性标准判定尚未统一。常规IHC判读标准如下：IHC 3+：5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色；IHC 2+：5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色；IHC 1+：5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；IHC 0：肿瘤细胞无着色。”,E Thunissen, et al. Virchows Arch(2012)461:245-257,NSCLC 活检组织标本,阴性或未知；,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,Ventana IHC,常规IHC检
15、测*,阳性,FISH,RT-PCR（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）,EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者,石蜡标本,3+/2+/1+,阴性,ALK阳性非小细胞肺癌,EGFR突变检测,ALK分离探针FISH原理,3-ALK探针杂交端粒的断点大约是300 KB，并用橘色荧光标示。 5-ALK探针杂交着丝粒的断点大约是442 kb，并用绿色荧光标示。,Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit. 06N38-020, 30-608495/R2,FISH诊断,橘红色与绿色探针相互临近或粘合：ALK 阴性,橘红色与绿色探针相互分离
16、或 单个橘红色探针：ALK阳性,FISH检测的局限性,结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读 晚期患者小活检标本(2mm)，很难保证每个视野存在50个癌细胞 价格昂贵，2600元左右/例，无法适用于筛选,FISH检测的优势,目前，临床研究的结果均是以FISH为检测手段,False positivity vs false negativity ,Split-signal FISH:,Fusion-signal FISH:,Translocation-positive,Translocation-negative,False-positive,False-negative,Micros
17、cope:,Sample/nucleus:,Slide:,在 ALK融合阴性的患者，免疫组化显示无ALK表达。,RT-PCR,FISH：进行Vysis LSI ALK双色打散FISH探针检测到ALK融合（分裂的红色和绿色信号）。,http:/dx.doi.org/10.1155/2013/757490,对 AmoyDx EML4-ALK融合基因检测，实时RT-PCR显示delta Rn对PCR循环数的变化。,在 ALK融合阳性的患者，免疫组化显示ALK表达。,RT-PCR临床检测数据：腺癌发生率7.7%,Probaility of disease-free survival,1.0,0.8,0
18、.6,0.4,0.2,0.0,6.0,18.0,12.0,24.0,Time(months),Logrank,P=0.006,ALK positiveALK negative,J. X. Zhou，et al. Annals of Oncology 00: 17, 2012 doi:10.1093/annonc/mds626,多重RT-PCR测序,EML4-ALK变异体的多种引物，GAPDH作为对照,GLCI内部数据：所有12个ALK融合阳性样品均通过多路RT-PCR测序技术得以证实。,国家药品食品管理局（SFDA）已批准的可用于临床的ALK融合基因检测的试剂盒（人类EML4-ALK融合基因检
19、测试剂盒，荧光PCR方法）,Ventana IHC 试剂设计,ALK融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表达较低Ventana IHC的原理:使用具有高度敏感性和特异性的一抗D5F3全自动仪操作，充分保证特异性独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性,D5F3 rabbitt monoclonal antibody,Optiview DAB IHC Detection,Optiview Amplification Kit,FISH阳性标本使用IHC检测,全自动Ventana IHC：信号扩增,常规IHC：无信号扩增,D5F3 rabbit mAb,Con
20、trol rabbit mAb,ALK-positive NSCLC by Vysis FISH and Ventana ALK IHC,ALK (+) 病例,全自动Ventana IHC,判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读 IHC 阳性 = FISH 阳性,EC Minca, et al. J Mol Diag, 2013,全自动Ventana IHC,价格便宜，可同时用于ALK的筛选和诊断,EMEA（欧盟）批准Ventana IHC用于诊断ALK阳性NSCLC，从而帮助确定可使用克唑替尼的患者,中国患者检测价格预估250元/例,ALK阳性NSCLC诊断方法专家推荐,ALK FISH
21、、Ventana IHC或基于序列特异性的PCR技术均可作为ALK阳性肺癌的诊断技术，检测实验室应该根据组织标本类型选择合适的检测技术。当怀疑一种技术的可靠性时（如FISH的肿瘤细胞融合率接近15时），可以考虑采用另一种技术加以验证。,日本肺癌协会ALK诊断共识,Yoshiko Murakami, et al. Frontiers in Oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024,欧洲11家中心病理科ALK诊断共识,Thunnissen E, et al. Virchows Arch . 2012;461:245257,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断
22、专家共识,ALK检测流程图 总体原则：,可考虑非排他性地优先检测部分潜在ALK阳性率较高的病理学特征富集的肺癌患者（如粘液型或含印戒细胞腺癌患者、EGFR基因状态为野生型的腺癌） 对于适合检测的肿瘤标本可选择直接采用FISH或RT-PCR方法或Ventana IHC进行分子检测诊断 对于EGFR基因状态未知，或EGFR突变患者在EGFR-TKIs治疗后原发或继发耐药的患者，由于存在EGFR和ALK双阳性的可能，因此也建议行ALK融合的检测,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK检测流程图 总体原则：,可考虑非排他性地优先检测部分潜在ALK阳性率较高的病理学特征富集的肺癌患者（如粘液型或
23、含印戒细胞腺癌患者、EGFR基因状态为野生型的腺癌） 对于适合检测的肿瘤标本可选择直接采用FISH或RT-PCR方法或Ventana IHC进行分子检测诊断 对于EGFR基因状态未知，或EGFR突变患者在EGFR-TKIs治疗后原发或继发耐药的患者，由于存在EGFR和ALK双阳性的可能，因此也建议行ALK融合的检测,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识,ALK检测流程图 总体原则：,可考虑非排他性地优先检测部分潜在ALK阳性率较高的病理学特征富集的肺癌患者（如粘液型或含印戒细胞腺癌患者、EGFR基因状态为野生型的腺癌） 对于适合检测的肿瘤标本可选择直接采用FISH或RT-PCR方法或Vent
24、ana IHC进行分子检测诊断 对于EGFR基因状态未知，或EGFR突变患者在EGFR-TKIs治疗后原发或继发耐药的患者，由于存在EGFR和ALK双阳性的可能，因此也建议行ALK融合的检测,NSCLC 组织标本,阴性或未知；,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,Ventana IHC,常规IHC检测*,阳性,FISH,RT-PCR（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）,EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者,石蜡标本,3+/2+/1+,阴性,ALK阳性非小细胞肺癌,EGFR突变检测,注： （1）* 对于部分无条件行Ventana IHC检测的医疗机构或中心，
25、常规ALK IHC可作为替代的筛选方法，但阳性标本需以FISH、Ventana IHC或RT-PCR进一步确诊 （2）建议优先在富集人群（粘液型腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选 （3）ALK抗体使用推荐：常规IHC建议使用CST公司的D5F3克隆号或Abcam或Novocastra公司的5A4克隆号抗体；Ventana IHC使用专用抗体试剂盒（D5F3） （4）流程图中的虚线：FISH、RT-PCR、Ventana IHC三种方法可相互验证结果 （5） PCR技术诊断ALK融合变异条件：PCR产物经测序后序列比对确认或基于特异性荧光探针的实时定量PCR的融合变异。单纯RT-PCR产物经电泳后的条带观察不推荐作为ALK融合基因诊断依据,谢谢！,
