1、小 RNA测序的一些可选的生物信息分析内容一、Small RNA 深度测序分析分子 RNA（Small RNA）是生命活动的一类重要调控因子，长约 1040nt，广泛存在于从低等的病毒、线虫、植物到高等的动物机体中。主要包括微 RNA(miRNA)、小干扰 RNA（siRNA）、与 piwi 相互作用的 RNA（piRNA）三类，它们通过包括 mRNA 降解、翻译抑制、异染色质形成等多种途径，在生物体基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。Small RNA 结合 Illumina HiSeq2500/MiSeq 新一代测序平台，一次性可获得数百万条 sRNA 序列
2、，通过生物信息方法，可以在全基因组水平快速鉴定和预测各种类型的 Small RNA，得到其可能调控的基因的功能，为 Small RNA 功能及其对基因调控机制的研究提供了有力工具。目前，提供 150bp 读长，HiSeq2500 、MiSeq 两种测序平台的 Small RNA 测序和信息分析服务。技术优势精确度高：可以检测出 sRNA 单个碱基的差异；灵敏度高：可以检测出组织中几个到几万个拷贝的 sRNA；价格低廉：一次可产出上百万条序列；样品起始量低：使用 NEB 原装 small RNA 建库试剂盒及配套试剂，样品起始量低至 3ug；既可以鉴定已知的 sRNA，又能够发现新的 sRNA。
3、生物信息分析内容标准信息分析内容及流程：图 1 Small RNA 标准生物信息分析流程图此外，Small RNA 还有如下可选分析内容：更多定制化分析内容，可以根据您的科研需求量身定制。项目流程诺禾致源严格的样品检测流程，规范化的建库操作，高稳定的测序平台为您的项目获得高质量的数据提供了有力的保证。HiSeq 2000 项目周期 45 天，MiSeq 测序项目周期 14 天。图 2 HiSeq/MiSeq Small RNA 项目流程图建库测序流程诺禾致源使用 NEB 针对 Illumina 测序平台研发的 Small RNA 建库试剂盒（NEB Multiplex Small RNA Li
4、brary Prep Set for Illumina）及配套的原装进口试剂，只需切胶一次，避免了反复切胶造成的 Small RNA 信息丢失，大大减少了所需的样品量。图 3 Small RNA 建库流程图二、mRNA 与 microRNA 联合分析microRNA 对靶基因的表达具有负调控作用。mRNA 与 microRNA 联合分析是基于将成对样品分别进行 Small RNA，转录组或数字基因表达谱（DGE）测序后，在标准信息分析基础上，对差异 microRNA 及其对应靶基因进行联合分析。利用两者数据贯穿分析，可有效提升数据利用率，提高 Small RNA 靶基因预测准确性，结合差异表达
5、 microRNA 和差异表达mRNA 的互作关系，能够得到多个 microRNA 与多个基因的调控关系网络。microRNA 与 mRNA 关联分析，可以广泛的应用于动植物的生长发育、基因调控机理、代谢及疾病的发生等领域。技术优势数据利用率高：有效提升数据利用率，充分挖掘 mRNA 和 Small RNA 的数据信息；无需二次测序：可直接利用 mRNA 和 Small RNA 的数据进行关联分析；优质技术服务：针对客户研究物种和目的，提供方案设计。联合分析内容案例解析案例一 心脏结构特异转录组数据表明 miRNA-mRNA 之间存在保守的相互作用（Vacchi-Suzzi C, et al.
6、 2013）研究背景miRNA 在基因表达的转录后水平调控中发挥重要作用，对心脏发育及心血管疾病的产生有重要影响。研究方法本研究对鼠、比格猎犬和食蟹猴三个物种心脏的 8 个不同组织分别进行小分子 RNA 测序，通过表达水平上的负相关性和靶基因预测找出与心脏功能相关的 miRNA-mRNA 之间的互作关系。研究结果1、在三个物种中的心脏瓣膜和心肌中各鉴定出了 9 个和 7 个保守 miRNA 被富集。用原位杂交的方法也同时验证了心肌中富集的 miR-1 和心脏瓣膜富集的 miR-125b-5p 和 miR-204 的组织特异性富集。2、通过表达水平上的负相关性和靶基因预测的方法鉴定出 miR-1
7、/Timp3、miR-125b/Rbm24、miR-204/Tgfbr2 和 miR-208b/Csnk2a2 之间的 miRNA/mRNA 互作关系（图 1），miRNA 与其靶基因呈负相关。3、通过测序数据分析构建了三个物种中的心脏结构特异的 miRNA/mRNA 表达数据集，为 miRNA 调节通路在心脏分子生理病理学研究提供了比较全面的数据。图 4 数据分析表明在不同组织中 miRNA 与其靶基因表达水平呈负相关实验流程图参考文献1. Vacchi-Suzzi C, et al. Heart Structure-Specific Transcriptomic Atlas Reveals
8、 Conserved microRNA-mRNA Interactions. PLoS ONE, 2013, 8(1): e52442. doi:10.1371/journal.pone. e52442.三、病毒 siRNA 鉴定近年来，越来越多的研究结果证实高通量 Small RNA 测序可以用于鉴定寄主中未知的病毒、类病毒（Maijuan M, 2011，Wu Q, 2012 ）。原因是病毒 Small RNA 分子相互重叠，使重叠群能够组装病毒基因组序列。高通量 Small RNA 测序技术为病毒快速鉴定提供了一种不需要分离培养、富集病毒的方法，大大缩短了鉴定周期。可广泛应用于虫媒传染病
9、的病原体监控和动植物病毒鉴定、检测和全基因组测序等领域。技术优势取样方便：无需离体培养病毒，直接提取感染病毒组织的 total RNA；无需参考基因组：在寄主没有参考基因组的情况下仍可对病毒进行鉴定；准确可靠：实验验证率达 80%以上。信息分析流程图 5 病毒鉴定项目信息分析流程图分析内容siRNA 拼接组装；与病毒数据库的比对注释，候选病毒筛选；候选病毒库的评估。项目流程案例解析案例一 不依赖序列相似性，通过深度测序和一种新算法来发现环状 RNA 类病毒（Wu Q, et al. 2012）研究背景类病毒是一类只感染某些植物的单链闭合环状、不编码蛋白的 RNA 分子。类病毒利用寄主的 RNA
10、 聚合酶，通过一种滚动循环机制产生多次头对尾重复的中间体来进行复制。在很多真核寄主中，由病毒引起的小干扰 RNAs（siRNAs）是一种抗病毒免疫反应，这些由病毒引起的 siRNA 通过 RNA 干扰（RNAi）或 RNA 沉默来特异的清除病毒 RNA。病毒衍生的siRNA 和的 piRNA 序列有重叠，因此有可能将它们组装成更长的片段来进一步组装获得病毒的基因组。研究方法本研究通过对被 PLMVd 感染的桃树和被 HSVd、GYSVd 感染的葡萄藤卷须的 Small RNA 文库数据进行分析，发明了一种鉴定环状 RNA 类病毒的新算法 PFOR，用它从葡萄藤卷须 Small RNA 文库中鉴
11、定出一种新的环状 RNA 类病毒 GHVd，然后通过实验证明了 PFOR 可以预测获得新的类病毒 98%的序列，在意大利和加利福尼亚葡萄藤中均有 GHVd 类病毒，且序列相似度高达 99%。研究结果1、用软件 Velvet 和 Vcake 能够将文库中的类病毒组装成各种长度的 contigs，且类病毒的 sRNA 序列有重叠，但用这 2 个软件将这些 contigs 与已知的类病毒进行相似性比对，没能发现新的类病毒；2、发明了一种发现类病毒的新算法 PFOR。通过对两种植物被侵染组织的 Small RNA 进行组装，证明了 PFOR 能够快速的富集类病毒产生的 siRNA，并组装获得类病毒的全
12、长；3、从葡萄藤中鉴定出一种锤状类病毒 GHVd。通过 RT-PCR，证明 PFOR 能够预测出 GHVd 序列全长的 98%；4、实验证明 GHVd 类病毒 RNA 的锤状核糖酶具有酶活性；5、通过 Northern 杂交和 RT-PCR 在意大利和加利福尼亚葡萄藤中均检测到类病毒 GHVd，序列相似度高达 99%。图 6 375nt 的环形类病毒 GHVd 的 RNA 二级结构预测和 RT-PCR、Northern blot 检测结果参考文献1. Maijuan M, et al. Discovery of DNA viruses in wild-caught mosquitoes using Small RNA high throughput sequencing. PLoS ONE. 2011; 6(9):e24758. doi: 10.1371/journal.pone. e24758.2. Wu Q, et al. Homology-independent discovery of replicating pathogenic circular RNAs by deep sequencingand a new computational algorithm. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Feb 15.
