1、目录第一篇 生物制品总论 4第一章 生物制品概述 4第一节 生物制品的概念、种类和用途 4第二节 生物制品发展史 5第三节 我国生物制品的发展 7第二章 生物制品的制备 11第一节 一般生物制品的制备方法 11第二节 各类生物制品的分离纯化方法 15第三节 基因工程制品的制备 28第三章 生物制品的质量管理、检定与标准化 40第一节 生物制品的 GMP 管理 .40第二节 生物制品的质量检定 43第三节 基因工程生物制品的质量检测与控制 57第四节 生物制品的标准化 62第四章 生物制品的包装、保存与运输 66第一节 生物制品的包装 66第二节 生物制品的保存与运输 72第五章 生物反应器极其
2、检测和控制系统 76第一节 概 述 76第二节 生物反应器的类型及其基本结构 76第三节 生物反应器的检测和控制系统 80第六章 生物制品生产中的安全防护技术 84第一节 化学防护技术 84第二节 生物学防护技术 88第三节 生物制品中的废物处理 93第二篇 疫苗 97第七章 疫苗概论 97第一节 疫苗的历史、发展和前景 98第二节 疫苗的成分、性质和种类 103第三节 生物制品菌毒种的筛选与管理 109第四节 计划免疫与联合免疫 112第五节 免疫佐剂的发展与应用 117第六节 疫苗与免疫 123第八章 基因工程疫苗 130第一节基因工程亚单位疫苗 131第二节基因工程载体疫苗 132第三节
3、核酸疫苗 134第四节基因缺失活疫苗 136第五节蛋白工程疫苗 136第六节 转基因植物疫苗 136第七节 基因工程疫苗的优越性及其发展重点 139第九章 细菌类疫苗 141第一节 概述 141第二节 细菌灭活疫苗 143第三节 细菌减毒活疫苗 148第四节 类毒素疫苗 157第五节 细菌多糖疫苗 163第十章 病毒类疫苗 165第一节 概述 165第二节 肝炎疫苗 167第三节 艾滋病疫苗 177第四节 脊髓灰质炎疫苗 183第五节 麻疹疫苗 186第六节 流行性腮腺炎疫苗 188第七节风 疹 疫 苗 190第八节 水痘和带状疱疹疫苗 191第九节 流行性乙型脑炎疫苗 193第十节 狂犬病疫
4、苗 196第十一节 流行性感冒疫苗 198第十二节 流行性出血热疫苗 199第十三节 其他正在研制的病毒类疫苗 200第三篇 血液制品 208第十一章 血液及血液制品概述 208第一节 血液及血液制品概述 208第十二章 血液制品及其生产技术 214第一节 概述 214第二节 血液制品的种类、用途和控制 215第三节 血液制品生产技术 225第十三章 人血液代用品 231第四篇 生物技术药物 236第十四章 生物技术药物概论 236第十五章 细胞因子类药物 243第一节 概述 243第二节 白细胞介素 247第三节 肿瘤坏死因子 250第四节 干扰素 252第五节集落刺激因子 254第六节生长
5、因子 258第十六章 重组激素类药物 261第一节 重组人胰岛素 262第二节 重组人生长激素 264第三节 促性腺激素类药物 265第十七章 重组溶血栓药物 267第十八章 重组可溶性受体和黏附分子药物 273第一节 概述 273第二节重组可受体 273第三节 黏附分子 277第十九章 基因治疗与核酸药物 279第一节 基因治疗 279第二节 核酸药物 286第二十章 抗体药物 297第一节 概述 297第二节 抗毒素与免疫血清 299第三节 单克隆抗体 304第四节 基因工程抗体 308第一篇生物制品总论第一章 生物制品概述第一节 生物制品的概念、种类和用途一、生物制品学及其发展生物制品学
6、（bioperparatics）是指研究各类生物制品的来源、结构功能特点、应用、生产工艺、原理、存在问题与发展前景等诸多方面知识的一门学科。生物制品是现代医学中发展比较早的一类药品，随着相关学科和技术的发展，其种类和品种不断增加，在疾病预防、治疗和诊断中起重要作用。然而，在较长时期内，它并没有成为一门学科，可能是因为它所包含的经验性成分比较多，缺乏形成独立学科的理论基础。20 世纪 40 年代以后，人们对微生物的遗传、营养、代谢，以及它们的致病因子和免疫结构有了较为系统的研究。另外，自 20 世纪 50 年代以来，克隆选择学说、免疫球蛋白的结构、巨噬细胞及T 细胞和 B 细胞的功能、主要组织相
7、容复合物（MHC）的参与、抗体形成的遗传基础、细胞因子的作用等逐步得到阐明，免疫学作为生物制品学的一门重要基础学科，开始被独立研究。更重要的是分子生物学的兴起，提供了基因工程和杂交瘤两种有划时代意义的新技术，发酵工程和蛋白质化学的发展提供了现代生物反应器和蛋白质的分离纯化、检验技术。目前，生物制品已经发展成为以微生物学、免疫学、生物化学、分子生物学等学科为理论基础，以现代生物技术包括基因工程、发酵工程、蛋白质工程等为技术基础的一门新的独立学科生物制品学。二、生物制品的概念和种类2005 年版的中华人民共和国药典 （三部）关于生物制品的定义为：生物制品 （biological product）是
8、以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。人用的生物制品包括：细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、体内及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生物制剂等。生物制品种类繁多、用途各异、研究目的不同，其分类方法也不一样。根据其组成及用途可分为预防制品、治疗制品和诊断制品。1.预防类制品这类制品主要是疫苗，用于疾病的预防。根据其抗原来源可分为细菌类疫苗、病毒类疫苗及联合疫苗。细菌类疫苗是由细菌、螺旋体或其衍生物制成的疫苗。病
9、毒类疫苗是由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的疫苗。联合疫苗是由两种或两种以上疫苗抗原的原液配制而成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或活疫苗，如百日咳、白喉、破伤风联合疫苗（DTP） ，麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗(MMR)等。预防接种疫苗可使个体或得主动免疫，使机体获得长期的对某种传染病的抵抗性。但从预防接种到特异性免疫力的建立，需要一个过程（即诱导期） ，这就难以适应“应急”预防的需要。因此，对某些传染病，可采用注射免疫球蛋白或特异免疫球蛋白的方法，使机体获得被动免疫而暂时提高免疫水平。这也是一种有效的预防措施，能较快地对机体起到保护作用。但是，被动免疫的预防效果不能持久。2.治疗类制
10、品是用于临床疾病治疗的生物制品。主要有免疫血清、血液制品、重组细胞因子制品、抗体药物、重组激素药物、核算药物等。3.诊断药品用于检测各种疾病或机体功能的各类诊断试剂统称为诊断药品，可用于指导疾病的预防和治疗。利用生物技术开发的多种诊断试剂，使得人们对疾病的诊断更为快速、便捷、准确。诊断药品的品种繁多，用途各异，根据应用范围和本身的性质，可分为：临床化学试剂，如血清酶类试剂、葡萄糖和蛋白质试剂等。免疫学诊断试剂，如免疫球蛋白测定试剂、补体测定试剂和常用抗体等。细菌学诊断试剂，如伤寒沙门菌“O” 、 “H”菌液，沙门菌属诊断血清等。病毒学诊断试剂，如乙型肝炎病毒表面抗原、核心抗体的诊断试剂，HIV
11、 抗原、抗体诊断试剂等。肿瘤诊断试剂，如 AFP 检验试剂、CEA 检验试剂等。其他常用诊断试剂，如妊娠试剂、抗 ABO 血型系统诊断试剂等。第二节 生物制品发展史生物制品学是伴随着生物技术的发展而发展的，同时又与微生物学、免疫学、生物化学及分子生物学等基础理论的发展密不可分。预防天花的疫苗是最早发展起来的生物制品。人为方法预防天花的最早记载是我国的宋代。宋真宗时，有峨眉山人曾为丞相王旦的儿子接种人痘预防天花，创造了“以毒攻毒”的预防方法，这是人类使用疫苗预防传染病的最早记载。18 世纪末天花在欧洲肆虐横行，当时人们注意到一个奇怪的现象，一些挤牛奶的农妇很少得天花，这可能是因为那些挤牛奶的农妇
12、在与奶牛接触的过程中感染了症状较轻的牛痘。1796 年，英国医生 Jenner Edward 第一次用牛痘苗接种人体取得了巨大的成功，从此种植牛痘的技术传遍了欧洲，后又传到北美洲和亚洲。19 世纪中叶随着微生物学的蓬勃发展，人们相继认识了各种病源微生物。1876 年，德国人 RoberKock 首先发明了细菌分离培养法，从此陆续发现了各种致病细菌。1889 年，首次发现人畜共患的口蹄疫这种由病毒引起的传染病，不久，引起脊髓灰质炎、 ，麻疹、天花和黄热病的病毒也相继被发现。人们在发现和认识各种病原微生物的同时，也在试图采用各种手段来控制这些病毒微生物引起的传染病，其中疫苗的研究和发明是这一领域中
13、最杰出的贡献，而在疫苗研制领域贡献最突出的当属法国人 Pasteur，他先后发明了减毒的鸡霍乱疫苗、减毒的畜炭疽疫苗和减毒的狂犬病毒疫苗，从此人工减毒活疫苗的研究不断发展，迄今不衰。但是在研制减毒活疫苗的过程中人们发现，有些微生物的毒力不易减弱，或毒力减弱后就失去了免疫原性，或减弱后有毒性恢复的危险，因此不得不另想办法。1886 年 Salmon Smith 发现加热杀死的强毒猪霍乱杆菌仍具很好的免疫原性，随后鼠疫、霍乱、伤寒、百日咳等死菌疫苗相继问世。到 19 世纪末，已经能够在分离到新的病原菌后不久就研制出相应的死疫苗并用于临床预防感染。有的细菌如白喉和破伤风等的致病因子不在菌体本身，而在
14、于细菌所产生的毒素。毒素虽然是很好的抗原，但因其毒性太强，不能注射人体。1923 年，法国人 Ramon 用甲醛解毒的好方法，把白喉和破伤风等毒素变成无毒而有免疫原性的类毒素。19481950 年 Enders 等人用人胚胎非神经组织培养脊髓灰质炎病毒获得成功，随后细胞培养病毒技术得到飞速发展，病毒学突飞猛进，培养出多种病毒，病毒性疫苗也不断诞生，如麻疹减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗等，极大地提高了人类抵抗传染病的能力。1890 年，Behring 和 Kitasato 用经三氯化碘减毒处理的白喉及破伤风毒素免疫动物获得成功，此后，Behring 又发现在经免疫的动物血清中含有免疫
15、物质，如把这种免疫血清移注给正常动物，也能使后者获得对相应疾病的抵抗力，从而创造了“血清疗法” 。免疫血清中的这种免疫物质就是免疫球蛋白。血液制剂是在输血基础上发展起来的在 20 世纪 30 年代就已出现了冻干人血浆制品。在第二次世界大战期间，为了充分利用血液中的各种有用成分，开始研究血浆蛋白的分离。19431945 年，先后从人血浆中提制成功白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白海绵等制品供临床使用。随着低温乙醇法分离血浆蛋白组分工艺的日趋成熟和蛋白分离技术的不断革新，目前已能从正常人血浆中制备10 多种常用血浆蛋白制品，可分离提纯 100 多种血浆蛋白。对细胞因子的研究是随着科学技术的不断进步而发展
16、、丰富起来的。细胞因子的研究主要经历了三个时期:细胞生物学时期、蛋白质时期和分子生物学时期。细胞生物学时期重点研究各类细胞因子的诱生、检测及其生物学活性，建立分泌细胞因子的传代细胞系及 T-T 细胞杂交瘤等。由于早先研究的是淋巴细胞产生的几种因子，所以直到 1969 年，还把当时研究的细胞因子都命名为“淋巴因子” 。最早的研究可追溯到 20 世纪初，法国教授 Carnot 认为存在一种能调控红细胞生成的“血循环物质” 。其后，从 20 世纪 50 年代中期直至 90 年代，各国科学家先后发现了干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子及转移因子等一系列的细胞因子，并于 70 年代末期陆续对
17、各种细胞因子做了科学的命名。在蛋白质化学时期，研究者们利用 20 世纪 70 年代逐渐发展起来的蛋白质化学技术（如超滤、层析、电泳、蛋白测序等） ，集中于细胞因子的分离、纯化、鉴定及理化特性分析。分子生物学时期研究各类细胞因子的克隆，基因结构及表达、调控等。基因工程产品即重组细胞为其主要研究内容，当前生物制品领域中涉及的干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素等十多种细胞因子制剂中，绝大部分是基因重组产品。诊断试剂的发展萌芽于 19 世纪末，1895 年就已制造出可用于治疗和诊断的康炭疽菌血清。其后诊断细菌用的试剂随着细菌培养的改进而得到迅速发展。每当分离出某种抗病原菌，
18、即有相应的诊断血清诞生。至 20 世纪 30 年代，细菌诊断血清日臻完善。病毒学诊断试剂的发展稍滞后于细菌学诊断试剂。而免疫学诊断试剂的发展更晚。但所有类型的试剂都同细菌学诊断试剂一样，随着该科学的进展而不断改进和发展。近年来，生物技术在新型生物试剂与生物制品开发中的应用，取得了颇有成效的进步，特别是基因工程技术的应用，使生物技术药品种不断增多。生物制品的发展史从一个侧面展现了生物科学技术和相关学科发展史的发展，随着高新生物技术和相关学科的进步，将会不断涌现出种类更多、质量更高、临床预防、治疗和诊断人类疾病效果更好的新型生物制品。第三节 我国生物制品的发展我国生物制品的发展可以追溯到宋朝时期，
19、宋真宗时，人痘技术已开始在我国使用。由于在天花流行期，接种人痘可以大大降低自然感染的死亡率，到了明朝，人痘已广泛被使用，并在 1718 世纪传到世界各国。人痘可以说是我国生物制品的萌芽，但直到 1919 年，我国才出现真正意义上的生物制品。1917 年绥远（现内蒙古自治区的一部分）的萨拉齐发生鼠疫，鼠疫被扑灭后于1919 年在北平天坛成立了中央防疫处（北京生物制品研究所的全身） ，这是我国第一所生物制品研究所。1935 年在兰州建立了兰州制造所，名为西北防疫处。在旧中国生物制品未得到应有重视，规模很小，发展缓慢，当时的制品只有十几个品种。病毒性疫苗只有牛痘苗和羊脑狂犬病疫苗两种，细菌性疫苗只生
20、产一些死疫苗，类病毒、抗毒素和其他免疫血清等都是粗制品，质量低下，生产数量也有限。新中国成立后，提出“预防为主”的卫生工作方针，生物制品获得迅速发展，主要表现在以下几个方面。一、 机构的建立1. 生物制品研究所中华人民共和国成立初期，首先整顿了生物制品的体制，把私营生物制品厂并入国营企业生物制品研究所。通过机构调整，成立了北京、上海、武汉、长春、兰州、成都六个规模较大的生物制品研究所，一个主要研究生产脊髓灰质炎疫苗的研究所-中国医学科学院昆明医学生物学研究所和成都输血研究所。研究和生产的品种主要是一些常用的预防性制品和血液制品。各研究所直属卫生部领导。2. 中国生物制品检定所成立于 1950
21、年，20 世纪 60 年代初与中国药品检定所合并，现称中国药品生物制品检定所，为药品、生物制品质量把关，代表国家监督生物制品规程和药品生产质量管理规范 （简称 GMP）的执行，有权抽查各研究所的制品质量，凡抽查发现不合格的制品，有权令其停止使用。3. 生物制品委会生物制品委员会（现称标准化委员会）是我国生物制品最高学术咨询组织，负责制定和审查中国生物制品规程 ，于 1989 年成立，下设五个分委员会：病毒制品委员会、细菌制品委员会、血液制品委员会、生物工程产品委员会和诊断试剂委员会。二、 生产的发展20 世纪 8 年代后我国生物制品进入高速发展期，生物制品的种类、剂型快速增加。生物制品的质量实
22、行与国际接轨，老的品种绝大多数已达到 WHO（世界卫生组织）规程的要求，新的品种一律实行 WHO 标准或国际标准。国家提出生物制品企业要率先达到 GMP（good manufacturing practice）要求，尤其是血液制品生产企业。生物技术产品生产车间或企业均按 GMP 的要求设计、建设和验收，其他制品生产车间也将逐步通过技改达到 GMP 要求，使生物制品走向国际市场。目前我国人用生物制品包括细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子、体内及体外诊断制品以及其他活性制剂（包括毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、重组 DNA 产品、抗原- 抗体复合物、免疫调节剂、微生态
23、制剂等） 。1. 预防制品以六大生物制品研究所为主，我国目前每年可生产供应预防制品近 10 亿人用剂量。由于疫苗的长期大面积使用，1964 年对天花在我国完全被消灭；目前脊髓灰质炎（小儿麻痹症）也基本被消灭；自 1992 年对新生儿实施乙肝疫苗接种，乙肝带毒率已由 16%降至 10%以下，只要继续接种疫苗， “肝炎大国”的帽子必将被摘掉。目前许多传染病在很大程度上都已得到控制，传染病对人民的危害程度已由中华人民共和国成立初期的第一位下滑到十名之外，说明我国在疾病预防接种领域已取了很大成绩。但是，人类与传染病的斗争永无止境。某种疾病被控制以后，在较长的巩固时期内仍须使用相应预防制品。由于基因的突
24、变、毒力基因的转移等因素，会出现新的病原微生物，引发新的传染病，而人口流动、国际交往、环境恶化、战乱、毒品、洪水等因素可能导致原已被控制的传染病又死灰复燃。近 30 年来，全球新出现约 40 种传染病，加之重又流行的，有近 60 种。有些危害很大，如 HIV 感染者，从 20 世纪 80 年代初发现以来已达 5000 多万人，我国也有 100 多万人，并进入感染的快速增长期。因此，预防制品的应用和深入研究仍很重要。2. 血液制品血液制品是以人血浆为原材料，采用蛋白质分离技术经深加工制备而成的（国际通用的 cohn 低温乙醇法） ，在临床抢救和治疗过程中被广泛应用，包括白蛋白、免疫球蛋白、各种凝
25、血因子等，是救死扶伤的重要药品。血液用品的临床使用量巨大，在 1995 年左右，国内生产企业大批涌现，目前大部分都通过了 GMP 认证。3. 诊断试剂诊断试剂是诊断、检测疾病的重要工具。根据生物化学、微生物学、免疫学、分子生物学原理，不断发展出各种诊断试剂。生物技术的发展，使得抗原、抗体的制备，可采用杂交瘤技术（单克隆抗体） 、多肽合成法或用基因工程技术大量生产，使酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）/固相放射免疫试验（radioimmunoassay,RIA ）诊断的精确度更高；20 世纪 90 年代发展起来的多聚酶链式扩增技术（
26、PCR）及近年来迅速发展的基因芯片技术，使人类诊断和检测疾病的手段深入到分子水平，诊断工具日益专一、快速，应用面更广，质量更高，经济效益更显著。肝炎、糖尿病和心血管病的临床治疗急需对甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶（glutamicpyruvic transaminase,GPT） 、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT）等许多生化指标进行检测，需要大量诊断用酶。我国应用酶工程、试剂盒、酶电泳以及诊断测试仪器，现已投入生产的新型乙肝病毒表面抗原凝集诊断试剂盒（乙肝病） 、丙肝病毒酶联免疫试剂盒（丙肝病） 、血糖没试剂盒（糖尿病） 、尿酸酶试剂盒（肾
27、病） 、丙谷转氨酶试剂盒（肝炎） 、谷草转氨酶试剂盒（心肌梗死） 、甘油三酯酶试剂盒（心血管病）等多种诊断试剂，并已经形成了中国自己的新型诊断试剂工业。4. 生物工程产品与技术自 20 世纪 70 年代基因重组诞生后，国际上生物技术的研究和发展十分厕所迅速。我国从 80 年代开始发展，90 年代实现产业化。1） 基因工程疫苗与药品是目前最活跃、发展最迅猛的高技术领域，也是 1997 年以来我国上市公司最青睐的领域。将天然活性蛋白的编码基因插入表达载体或引入某种宿主细胞后，有效表达该基因产物，再经分离、纯化和检定，可得到用于预防和治疗某些人类疾病的制品，诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、
28、干扰素等2） 单克隆抗体是用杂交瘤技术将抗原免疫动物后，取（鼠）脾或外周血淋巴细胞或经体外免疫获得的免疫淋巴细胞与相应的骨髓瘤细胞融合，建立能稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞株，通过体内法或体外培养法制备单克隆抗体，经提取纯化获得的特异性单克隆抗体制剂，可用于有关疾病的体内/ 外诊断或治疗。为了提高靶向治疗作用，常常要对单抗进行修饰，即与毒素、药物、放射性核素、酶、细胞因子等其他物质偶联形成免疫结合物，或在同一段多肽链中包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白，成为所谓的“ 导弹药物” 、 “生物导弹” 。从 20 世纪 70 年代末，我国开始研制单克隆抗体与导向药物杂交瘤单克隆抗体，现在已
29、经获得了大量杂交瘤细胞系和大批单克隆抗体诊断试剂盒。在肿瘤方面，利用单克隆抗体与毒素（如蓖麻毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素等） 、放射性核素或抗肿瘤药物（如阿霉素、丝裂霉素、氨甲蝶呤、长春新碱等）等进行偶联，制成导向药物，进行大量临床前的研究。此外，还进行人-人单抗研究。抗体工程也取得了多项成果，并开始应用于临床。我国开发的肝癌单克隆抗体定位诊断试剂盒填补了国内外空白，获得了 16 类 38 种抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体，已得到“国际人白细胞分化抗原大会 ”的确认，其中部分抗体结合免疫毒素已经用于骨髓移植，治疗多例白血病，取得了显著效果。3） 人体细胞治疗体细胞治疗是指应用人的自体、同种异
30、种或异种（非人体）的体细胞，经体外操作后回输（或植入）人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单核白细胞；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞（瘤苗）;体内植入经体外操作过的细胞群如干细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等。自 1993 年 5 月卫生部公布人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点以来，体细胞治疗的研究与应用进展很快，涌现出了许多新的技术方法，应用范围进一步扩大。由于体细
31、胞治疗的最终制品不是某一个单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性、复杂性和特殊性，因此不能像一般生物制品那样制定出适合于每一种方案的具体标准，而应具有情况具体对待。4） 人基因治疗基因治疗是指以改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生植细胞。基因治疗是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的。基因治疗的技术和方式日趋多样。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入人体内及体内导入两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是通过适当的导入系统直接将基因用于人体。1991 年我国对 B 型血友病进行了首次临床试验，取得了明显的疗
32、效。深圳市赛百诺基因技术有限公司开发的用于肿瘤治疗的重组腺病毒-p53 注射液，于2003 年 10 月获准新药证书和生产批文，是世界上第一个批准上市的基因治疗药物，为我国创造了生物高技术发展的新的里程碑。目前，我国基因治疗的研发和产业化的单位主要有：深圳赛百诺基因技术有限公司，其研发的重组腺病毒制品，用于肿瘤和心血管的基因治疗；上海肿瘤研究所，其研发的重组反转录病毒，用于肿瘤基因治疗：中国疾病预防控制中心病毒研究所和北京本元正阳基因技术股份有限公司的腺相关病毒载体技术，与国内多家合作，用于肿瘤、遗传病的基因治疗；复旦大学与本元正阳公司合作，进行血友病的基因治疗；北大医学院用裸 DNA 对外周
33、血管病进行基因治疗。我国的 13 亿人口和不断提高的生活水平及医疗水平，形成了我国巨大的生物制品市场。20 世纪 90 年代以后，不但国内的生物制品企业如雨后春笋般遍地而起，国外的生物制品生产企业也看好我国市场，纷纷合资建厂或申请进口注册。这些进口制品中既有我国目前已成熟的品种，也有我国尚处于研制阶段的品种。国外先进技术的引进，促使生物制品研制的起步较高，在一定程度上缩短了我国与发达国家的距离。但是，太多生物制品造成严重的重复建设、生产过剩。例如，目前我国生产乙肝、丙肝、艾滋病诊断试剂的企业多达 50 多家，而外资在我国注册生产这三种诊断试剂的企业也有 20 多家。可想而知竞争之激烈。重复和竞
34、争的结果是，国内一些小企业很快倒闭，存留下的企业为了争夺市场，采用各种手段进行销售，并大打价格战。高科技的产品无法获得高额利润，使企业没有充足的资金用于产品质量的再提高、新项目的开发，这种恶性循环的结果是企业最终失去核心竞争力，严重影响了我国生物制品行业的整体发展。因此，国家在鼓励和支持生物制品产业发展的同时，还要根据不断变化的市场制定有效的产业政策，加强生物制品的进口管理，扶持大型的、具有较强研发能力的企业，鼓励创新，减少重复，理顺生物制品/药品的流通渠道。三、 制品质量的管理生物制品是一类特殊的药品，它除用于临床治疗和诊断以外，主要用于预防疾病，接种对象多为儿童。质量好的产品可增强人的免疫
35、力，防治疾病，造福人民。质量差的制品不但不能保障人民的健康，还可能带来灾难。因此，其质量与人的生命攸关。从我国生物制品质量管理上看，它的发展大致可以分为以下几个阶段：20 世纪 2040 年代为质量管理的“成品把关”阶段，即单纯依靠成品检定，剔除废品。当时既无生物制品制造检定规程，也无统一的制品质量标准，制造检定无章可循，方法随人而异。5070 年代发展到“初级预防”阶段，1952 年我国制定第一部生物制品规程 （草案） ，1959 年修订后经卫生部批准作为我国生物制品规程。1979 年又对生物制品规程进行了修订并制定出我国的生物制品制造检定规程。在此阶段已开始重视对生产菌种、毒种和半成品进行
36、质量控制，并加强了质量管理部门的职能，达到了“初步预防控制”制品质量的目的。80 年代以后发展为“全面质量管理”阶段，1988 年卫生部发布药品生产质量管理规范 ，对制品生产实行总体的、综合的全面管理，以确保制品质量。随着生物制品的发展，质量标准的提高，生产及检定方法的改进，卫生部又分别在 1990 年、1993 年、1995 年、2000 年和 2002 年对中国生物制品规程进行了修订。自 1951 年以来，该规程已有六版执行，分别为 1951 年及 1952年修订版、1959 年版、1979 年版、1990 年版及 1993 年版（诊断制品类） 、1995 年版、2000 年版及 2002
37、 年版增补版。2002 年翻译出版了第一部英文版中国生物制品规程（2000 版） 。在审批方面，为与化药学、中药区别，国家药品监督管理局专门制定了新生物制品审批办法 。2005 年版中华人民共和国药典将中国生物制品规程并入药典，设为药典三部（一部为中药，两部为化学药） 。第二章 生物制品的制备第一节 一般生物制品的制备方法一、 原料的选择、预处理和保存方法在生物制品的制备过程中，起始原料的质量是生物制品制备的基础，直接关系的终产品质量和生产工艺的稳定。因此，生产生物制品必须对起始原料提出一定的要求。1. 原料的选择生物原料可来源于人体、动物、植物、微生物及海洋生物的生物组织或分泌物，也可来源于
38、人工构建的工程细菌、工程细胞及人工免疫的动植物。1)原料选择的注意事项生物在不同的生长、发育期可合成不同的生化成分，所以生物的生长期对生理活性物质的含量影响很大。对于不同来源的原料，要注意选取其最佳生长时期。植物原料要注意它生长的季节性；微生物原料最好选取对数生长期，因此这时的微生物生长代谢能力最强；动物原料要选取适当的年龄和性别。2)选择原料时应遵循的原则选择原料时要遵循以下原则：原料来源丰富，产地接近，成本低；原料新鲜，其有效含量高并易于获得；杂质含量尽可能少，对原料中的杂质、异构体，必要时应进行相关的研究并提供质量控制方法；起始原料应质量稳定、可以控制，原材料应有来源、标准和供货商的商检
39、报告，必要时应根据制备工艺的要求建立内控标准。2. 原料的预处理生理活性物质易，失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜，防止腐败、变质及微生物污染。因此生物材料的采摘必须快速及时进行预处理并适当保存。对于动物原料，采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻储存。对于植物原料，要择时采集并去除不用的部分，然后进行保鲜处理。对于微生物原料，要及时将菌体与培养液分开，并进行保鲜处理。3. 原料的保存方法1)冷冻法适用于所有生物原料。常用-40速冻。如在-80-70可保存更长时间。2）有机溶剂脱水法常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体
40、等。3)防腐剂保鲜常用乙醇、苯酚、甘油等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。对于不同的生物还有不同的保存方法，例如，对于动物细胞，有组织块保存法，组织悬液保存法、单层细胞保存法等。二、 目的产物的提取提取（extraction）是分离纯化物质的第一步，其目的和作用是去除与目的物性质差异大的杂质，为后面的精致工序创造有利条件。1. 生物组织与细胞破碎生物制品大部分存在于生物组织或细胞中， ，因此，分离或提取这些产物或提高提取率，生物组织与细胞破碎（obtrite of tissue and cell）过程就显得非常重要。破碎细胞是为了破坏细胞壁，使细胞内容物有效地释放出来，获得有效的提取。
41、破碎的方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类（表 2-1） ，其中机械法主要靠剪切力来破碎细胞，包括高速匀浆破碎法、高速搅拌珠磨破碎法、超声波振荡破碎法、高压匀浆法等。机械破碎法的优点是速度快，处理量大，不会带入其他化学物质。其是会产生热量，要采取冷却措施，防止有效成分失活。非机械法相对较温和，细胞不能全部被破碎，或是细胞膜部分被通透而释放出目标蛋白等活性制品，包括渗透冲击破碎法，反复冻融法、热处理法、化学渗透法、酶解法等。非机械破碎法往往不能破坏 DNA，从细胞中释放出来的 DNA 会发生聚合，大大增加液体的粘合度。表 2-1 机械法和非机械法破菌比较项目 机械法 非机
42、械法破菌原理 机械切碎 溶解局部壁膜碎片大小 碎片细小 碎片较大内含物释出 全部 部分 时间、效率 时间短，效率高 时间长、效率低设备 专用设备 不需专用设备通用性 强 差成本 低 高适用范围 实验性，工业生产 实验室1) 高压匀浆法属于机械破碎法，所用设备是高压匀浆器，也称均质器。其破菌原理是：在高压下将匀浆以高速喷射到静止的环上，再被迫流出，其速度可达每秒几百米；再转到常压下，经此双重作用造成细胞破碎。此法的优点是可大规模地处理菌液；缺点是会使工作液升温，导致一些活性蛋白失活。不同的微生物，用高压匀浆器破菌的效果不同（表 2-2） 。为了提高破菌效果，可采用二次匀浆法。如将工作液预先冷却并
43、在二次匀浆过程中冷却工作液，可达到较好效果。2) 高速珠磨法也属于机械破碎法。所用设备是高速珠磨机。其原理是：微生物细胞悬浮液与极细的磨珠剂（通常是直径4*10 5g，一般需要 6*104r/min 以上才能沉降分离。离心机的样式和型号很多，按转速可分为普通离心机（5004000r/min） 、高速（800025000 r/min） 、超速（2500080000 r/min）和超高速（150000 r/min）离心机。生物高分子的相对分子质量10 8者可用高速和普通离心机，106108者应选用超高速离心机，10 6者用离心和超离心效果不好，需采用另外的方法。3)凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析（g
44、el filtration chromarography）也称分子筛层析、分子排阻层筛（molecular-exclusion chromarography） 。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小的不同进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物资，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就因不同相对分子质量被筛分开了。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行 ，不需要
45、有机溶剂，并且对分离成理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。将具有网状或锥形微孔结构的凝胶微球膨胀充满溶液后，装入足够高度（75100cm）的柱中，用缓冲液平衡后，将样品加在柱床顶端，待样品进入柱床，随即用平衡缓冲液流洗。当大小不一的分子在凝胶柱中流过时，直径大于凝胶的微孔者被排阻在微球之外，顺球间缝隙流穿而过，最先被洗脱出来，形成流穿峰；而直径小于凝胶微孔者，扩散进入球的微孔中，直径越小扩散得越快，进入得越深或进入的概率越高，因而在柱上滞留的时间越长，并按大小先后被洗脱（图 2-1） 。理论上当柱中原有溶液（包括微球外和微球孔内的溶液）被同体积的洗脱液更替时，样品中各组分
46、也应全部被洗脱，但因不同凝胶对样品组分存在一定的非特异吸附作用，实际结果要比理论上略滞后。凝胶过滤主要有脱盐和分级分离两大用途。脱盐是将小分子的无机盐与大分子的目的蛋白分离。在脱盐工艺，凝胶介质体积通常为样品体积的 45 倍，流速可达 200cm/h 左右。分级分离不但适用于实验室，还能应用于大规模生产。在分级分离时必须选用孔径适当、分离范围与样品分子大小相适应的凝胶，但上样量应控制在柱床体积的 5%10%，因此这种分离常用于浓缩后的样品。凝胶过滤层析靠不同大小的组分流经途程的长短之差达到分离目的，因此柱要有足够的长度，使不同组分拉开距离，然而微粒还有扩散效应，扩散与时间成正比，所以柱又不可太
47、长，普通层析柱以 75100cm 为宜。在大规模分离中采用“重叠式柱” ，即将几个不高的柱叠加起来，易于操作，其流速为同样体积常规柱的45 倍，且不影响分离效果。图 2-1 凝胶层析原理4)透析透析（dialysis）是利用半透膜的选择性在溶里分离大分子和小分子的一种分离技术，常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂，还原剂之类的小分子杂质，也可用于蛋白质溶液浓缩。主要使用半透膜制成的透析袋作为工具。首先将待去盐的蛋白质溶液放置于透析袋内，扎紧口后置于去离子水或低浓度缓冲溶液中，盐类或小分子物质即通过半透膜向低浓度的水或缓冲溶液中扩散直至平衡，而大分子则由于膜的阻拦而留在袋内，通过不断更换缓冲液
48、，即可将样品要除掉的小分子稀释到足够低的浓度，当将袋放入吸水剂时，袋内水分伴随小分子物质一起透出，达到浓缩的目的。2. 利用蛋白质的电性进行分离纯化有等电点沉淀法、离子交换层析法、电泳和等电聚焦法等。1） 等电点沉淀当蛋白质溶液的 PH=pI 时，蛋白质的静电荷为 0，因而失去了水化和分子间相斥的作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出，即等电点沉淀（isoelectric point precipitation） 。此法慢且不完全常与盐析、有机溶剂沉淀等联合应用。2)离子交换层析技术离子交换层析技术（ion exchange chromatography,IEC
49、）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。在不溶性介质上引进带电基团（酯化、氧化、醚化等）形成不同介质。引入正电基团的介质（交换剂）为阴离子交换剂，可以静电吸附阴离子；引入负电基团的介质（交换剂）为阳离子交换剂，可以静电吸附阳离子。蛋白质是两性电解质，在不同 PH 下可带不同的正负电荷。如溶液 PH 低于某蛋白质的等电点时，该蛋白质带正电荷，可交换吸附到阳离子交换剂上，与带负电荷的蛋白质分离；如溶液 PH 高于某蛋白质的等电点时，则它带负电荷，可交换吸附于阴离子交换剂上，与带正电荷的蛋白质分离。洗脱时可通过改变溶液的性质如改变 PH 及提高离子强度，将吸附在介质上的目的蛋白质解离下来。采用离子交换层析，一般是将处理好的固体离子交换剂装入柱内，先将待分离的、性质相近的混合样品溶液通过层析柱，使其被交换剂充分吸附。然后再用洗脱液进行洗脱，分别
