1、ImageJ软件在生物图像分析中的应用医学神经生物学国家重点实验室神经生物学系张雯婷2015年 1月 7日常 见 的图像处理 技术1.灰度增强2.伪彩色处理3.阴影校正4.平滑处理5.锐化处理6.分割处理 7.边缘检测分割处理及其原理1 . 像 素 分类 图像分割 是把 图像 分成 若干个 按 图像 的 某种特性（如灰度级，纹理等）的 区域 这样一种处理技术。在每一个区域内都有相同或相近的特性，而相邻区域内的特性则不相同。 图像分割 从本质上讲是将 各 像 素 点进行分类的过程。分类所依据的特性可以是 图像像素点 的 灰度 值 、 颜色或多谱特性 、 空间特性 或 纹理特性 。 门限 化操作进
2、行分类的 过程是基于 下列一个假设：每个区域是由许多灰度值相近 的像素 点所构成的， 物体和背景之间或不同物体之间的灰度值都有着明显的差别 ，从而可以通过门限化操作来加以区分 。待 分割 图像的 特性愈接近于这个假设，用这种方法分割的效果就愈好；否则，效果就愈差。2 . 门限化从 输入设备中获取的 灰度 图像 （ 或彩色 图像），是一种 多值 图像 （ 对于 8位数字 图像来讲 ，其灰度可取 256个不同数值），如果直接在其上面进行诸如面积、周长等 颗粒特征参数 的检测比较困难 。对于符合上述假设的 图像来讲 ，在作具体检测前，通常首先要对它 进行 门限化 操作以求得它的二值 图像 。门限化操
3、作 的 具体方法：设有一幅灰度 图像 g(m， n)，其灰度等级的范围为 z1， zk（ 例如 0， 255），t是 z1和 zk之间的某一个数，则设置 门限 （又称 阈值 ） t的操作是对 g(m， n)的每一个像素 点的灰度值进行检测，并根据下列关系创建另一幅 二值 图像 gt(m， n)（其内只有 0、 1二种灰度值。 注意 ：这里的 0、 1是 逻辑值 ，而不是具体数值，所以gt(m， n)是一幅 逻辑 图像 ） ：tn) g ( m ,018)-(2 N)0 , 1 , 2=n M;0 , 1 , 2=(mt=n) g ( m , 1=n) ( m ,g tifif上述操作可分别用图
4、 (a)、 (b)来表示。若 阳性颗粒内的 各像素 点的灰度值是 介于 门限 t1、 t2之间 （灰度值低于 t1的往往是切片样品中的污物，而高于 t2的通常是背景和其他非阳性颗粒内 的像素 点），则必须通过式 (2-20)操作得其的 二值 图像 gt(m， n)：o t h e r w i s eif020)-(2 N)0 , 1 , 2=n M;0 , 1 , 2=(mtAdjustThreshold (Auto) 对于荧光染色图像要勾选dark background，红色部分为所设定的测定目标 ， 按 set键进行设定， apply进行确认应用。 设 定参数，对免疫组化阳性表达的面积分布
5、、百分比分布、积分光密度、平均光密度、阳性细胞数量等参数进行量化。弹出 Set measurements对话框（ Analyze-Set measurements），选择上述所要观察的指标，点击 Ok确 认 如果需要计算实际的阳性面积大小，可以设定图片的标尺AnalyzeScale设定单位 (pixel to m ) Analyze Measure 获得计算结果计算目标颗粒的数目（方法一） 选择 Point Selection 选择标记细胞的标识所用的颜色EditOptionsColorsSelection（显著区别于计数目标的颜色） 打开 EditOptionsPoint Tool，在对话框
6、中选定 Auto Measure（可以同时调整 label的大小） 点击选中的点将在 Result窗口中显示其 xyz的位置和灰度值等参数 打开需要分析的图像（ 8-bit，对于 RGB图像需要进行 split color操作） 设定阈值 ImageAdjustThreshold对 于荧光染色图像要勾选 dark background Process/Binary/Watershed将 重叠的部分分开 设定计算参数 AnalyzeSet Measurements,勾选 Display Label Analyze Analyze Particles设定显示结果（设定颗粒的最大值和最小值） 在 R
7、esults窗口中会看到对应每个点的相应参数（面积、 xy的位置和直径等）包括颗粒的数目 优点：可以获得更多关于计数颗粒的信息 缺点：一次只能针对一种类型进行分析 ,计数误差比较大计算目标颗粒的数目（方法二） 打开 PluginsAnalyzeCell Counter 初始化 initialize 选定细胞的 type，如 type1，点击计数同类细胞 对于另外一种类型的细胞，可以选定 type2，点击细胞进行计数 Result显示每种类型中所计数到的细胞数目 Measure会显示所有计数过的细胞的类型、位置和灰度值等参数 优点：可 以同时计 数同一幅图像中所存在的多 种类型的 细胞计算目标颗
8、粒的数目（方法三）分析凝胶电泳图谱 （ 方法一） 打开 文件 , 在 ImageType下点击 8-bit将图像转换为灰度图像， 在 ProcessSubtract Background， rolling ball radius的参数设定为 50，去除图像的背景， 这个值越小，减去的背景色越多 。 AnalyzeSet Measurements，勾选 Area， Mean Gray Value和 Integrated Density AnalyzeSet Scale，长度单位设定为 pixel EditInvert(或 Ctrl+Shift+I)来反转图像中的颜色。此时，黑色区域变为白色，原来
9、的白色区域变为黑色，正如上面勾选出的，使得测定的数值随蛋白表达量的增加而增加 。 选择 freehand工具 在 第一条带的周边画圈，你需要自己判断条带的边界，将目的条带与背景区别开。 点击 m键，计算所圈定区域的相关参数，结果将在弹出的 result对话框中显示，所有在第 4步中选定的参数将在结果中 显示 。分析凝胶电泳图谱 (方法二 ) 打开 文件 , AnalyzeGelsGel Analyzer选项，勾选对话框中的 Percentages, Outline Lanes和 Invert Peaks。 选择矩形选择框工具，在第一条带上画一矩形框（矩形框的高度大于宽度），包括目的条带上下的一
10、定区域 。 点击 1或 AnalyzeGelsSelect first lane，一个新的窗口将弹出，并出现新的选择框。 使用 箭头工具将方框移到下一条带，按 2（或 AnalyzeGelsSelect next lane）将选择框移动到下一个条带，重复此项操作。 完成 后，按 3或选择 AnalyzeGelsPlot Lanes，弹出一个每一条带的 profile plot窗口。 选择直线选择工具，在每个峰的底部，画一直线，将峰变成一个封闭的区域，两侧为背景信号，如果有很多条带，后面的 lane将被隐藏在 profile plot的底部，如果需要看到这些条带，可以点击空格键，将鼠标向上拖动
11、。 当所有的峰都封闭后，选择 Magic Wand工具。 使用 空格键和鼠标，拖动 Profile Plot向下，使用 Wand工具，点击峰的内部，重复此操作。 选定峰后， AnalyzeGelsLabel Peaks，将会计算并标记每个波峰的面积百分比，此值即为该电泳图谱上各个条带的含量百分比，然后在 Results窗口中进行结果的复制和粘帖到 Excel表格中进行统计。http:/www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ 该软件是由 Eric Meijering开发的，用于测量神经元突起长度的 插件 下 载 neuron J软件，复制到 Image J软件的 Plugins文件夹中。 打开 Image J， 并 在 Image J中打开 Neuron J计算神经元突起长度 在 Neuron J的界面中选择并打开所要分析的图像（ file-open），需要强调的是， Neuron J只能打开 8-bit的图像，如果原始图像不满足该要求，最好先用 Image J打开图片，将其另存为 8-bit的图像用于 Neuron J分析。 点击 Add tracings键，将所要计算长度的突起用线画出。 设定图片的标尺（ Analyze-Set scale） Analyze-measure结果 中的长度就是突起的实际长度
