1、 1/20目 录1.概述2.验证范围3.验证目的4.验证参考文件5.验证小组名单6.验证小组职责7.验证内容8.结论与评价9.再验证周期2/201. 概述1.1. 本公司的洁净区分为 A 级、B 级、C 级和 D 级，拟定用于洁净区表面消毒的有三种消毒剂：75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、2%甲酚皂溶液。本次验证方案将选用以上3 种消毒剂分别进行验证试验。1.2. 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期见下表：序号 名称 消毒对象 消毒方法 有效期1 75%乙醇 用于设备表面、器具和手消毒。 采用擦拭或喷洒方式 密闭保存 7 天2 0.1%新洁尔灭溶液 用于地面、墙面、器具、清洁 布、拖布和
2、洁净鞋的消毒 采用擦拭或浸泡方式 密闭保存 7 天3 2%甲酚皂 用于水池和地漏、地面的消毒 用于液封 密闭保存 7 天备 注 以上消毒剂浓度均为体积分数比。1.3. 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利用消毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于 10 分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于 5 分钟。1.4. 为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。实验室考察部分，定量悬浮试验法适用于浸泡或液封方式的消毒方法；表面实验法适用于擦拭或喷洒方式的消毒方法。洁净区设施表面材质有不锈钢、镀锌板及玻璃三种，故表面试验法选用不锈钢载
3、片、镀锌板及玻璃载片模拟洁净区设施表面进行验证试验。现场考察试验部分选择冻干车间的配液间（C 级洁净区） 、灌装间(A/B 级洁净区)、灌装间操作人员手部消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。1.5. A/B 级洁净区使用的消毒剂需经 0.22m 除菌过滤。2. 验证范围本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。3. 验证目的通过消毒剂消毒效果及有效期的确认，科学制订消毒程序，以保证各洁净级别的操作间及设备外表面、人员手部按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒防止污染的效果。4. 验证参考文件药品生产验
4、证指南 （2003 版） ；医疗机构消毒技术规范 （2012 年版） ；中国药典 （2010 年版） ；药品 GMP 指南-无菌药品 、 现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术 。3/205. 验证小组名单组 长姓 名 职务/职称 部 门* 经理 质量部成 员* 车间主任 生产部* QC 主管 质量部* QC 质量部* QA 主管 质量部6. 验证小组职责7. 验证内容7.1. 验证前参与实施验证的人员必须已经接受本方案的培训且考核合格。见附表 1。7.2. 验证前准备7.2.1. 菌种7.2.1.1. 试验微生物以金黄色葡萄球菌作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌作为细菌繁殖体中肠
5、道菌的代表；白色念珠菌作为致病性真菌的代表。在上述规定的菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。7.2.1.2. 75%乙醇、2% 甲酚皂为中效消毒剂，0.1%新洁尔灭为低效消毒剂，均不具备杀灭细菌芽孢功能，根据上述内容，本次验证所用菌种见下表：序号 名称 序列号 类别1 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26 003 细菌2 大肠埃希菌 CMCC(B)44 102 细菌4 白色念珠菌 CMCC(F)98 001 真菌7.2.1.3. 可接受标准：标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。使用的标准菌种不能超过第五代。7.2.1.4. 应确认菌种名称、来
6、源、代数，见附表 2。7.2.2. 试剂及培养基4/207.2.2.1. 选用培养基见下表：序号 名称 备注1 营养琼脂培养基 121， 15min 灭菌备用2 玫瑰红钠琼脂培养基 121， 15min 灭菌备用3 胰酪胨大豆琼脂培养基 121， 15min 灭菌备用7.2.2.2. 稀释液、冲洗液：0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 。7.2.2.3. 可接受标准：所有试剂、培养基的规格、数量和保存条件满足要求，且在有效期内；脱水培养基呈流动粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。7.2.2.4. 试剂/培养基检查确认记录见附表 3。7.3. 消毒剂配制：按清洁剂、消毒剂
7、的配制与使用标准操作程序进行消毒剂配制。7.4. 定量悬浮试验7.4.1. 目的：0.1%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液、 2%甲酚皂溶液消毒效力的确认（定量悬浮试验法） 。7.4.2. 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于3035培养 1824h 即得，培养后微生物浓度应不少于 105cfu/ml。取白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于 2328培养 2448h 即得，培养后微生物浓度应不少于 105cfu/ml。7.4.3. 将配制好的 0.1%新洁尔灭溶液（或 75%乙醇溶液或 2%甲酚皂溶液）按 9ml/支分注于 27 支无菌具塞试管中，按照“5 分钟组”
8、 、 “10 分钟组”和“15 分钟组”共 3 组每组 9 支，进行分组编号。7.4.4. 取供试菌液（10 5cfu /ml 的金黄色葡萄球菌菌液，10 5cfu /ml 的大肠埃希菌菌液，105cfu /ml 的白色念珠菌菌液）1ml 按照下表，分别接入到盛有 9ml0.1%新洁尔灭溶液（或 75%乙醇溶液或 2%甲酚皂溶液）的试管中（已进行 10 倍稀释） ，轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。菌种名称 5 分钟组 10 分钟组 15 分钟组金黄色葡萄球菌 1ml/支，共 3 支 1ml/支，共 3 支 1ml/支，共 3 支大肠埃希菌 1ml/支，共 3 支 1ml/支，共 3 支 1
9、ml/支，共 3 支白色念珠菌 1ml/支，共 3 支 1ml/支，共 3 支 1ml/支，共 3 支7.4.5. 试验方法分别在 5 分钟、10 分钟和 15 分钟取接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过，然后各用 0.9%无菌生理盐水 50ml 清洗滤膜，滤过，重复用 50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共5/203 次。取下滤膜，含细菌的膜放入营养琼脂平板内，含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含菌膜面向上。细菌于 30-35的生化培养箱内培养 3 天，真菌于 23-28的霉菌培养箱内培养 5 天。培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。7.4.6. 阳性对照分别将 105cfu/
10、ml 金黄色葡萄球菌菌液、10 5cfu/ml 大肠埃希菌菌液、10 5cfu/ml 的白色念珠菌菌液逐级稀释至浓度为 10100cfu/ml，取稀释菌液 1ml 于平皿中，倾注冷却至 45营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于 30-35的生化培养箱内培养 3 天，真菌于 23-28的霉菌培养箱内培养 5 天。培养结束后对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认记录见附表 475%乙醇溶液消毒效力确认记录见附表 52%甲酚皂溶液消毒效力确认记录见附表 67.5. 表面实验7.5.1. 目的:由于 75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液要通过擦拭消
11、毒，故选用不锈钢载片及玻璃载片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。7.5.2. 工作菌液制备 同 7.4.2.项下菌液制备。7.5.3. 染菌不锈钢载片制备：将经灭菌的不锈钢载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为 11085108CFU/ml 的菌液 0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片；染菌玻璃载片制备：因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mm50mm） ，标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢
12、载片制备。7.5.4. 取样 7.5.4.1. 试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5min、10min、15min，不锈钢载片、镀锌载片及玻璃载片每个作用时间分别制备 2 个。作用结束后，用接触碟取样（接触碟规格：55mm ，取样面积为 25cm2） 。取金黄色葡萄球菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取大肠埃希菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟； 取样白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基接触碟。接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触 10 秒左右，盖上碟盖。7.5.4.2. 对照组：对照组的活菌浓
13、度同工作菌液的制备。阴性对照：用接触碟在已灭菌的载片上（未染菌片的载片）按压取样，操作同上。每种载片及每种接触碟平行制备两份。7.5.5. 培养：将取样金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的接触碟倒置于 3035培养 3 天6/20计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于 2328培养 5 天计数计数。7.5.6. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度 （CFU/ml） ，并换算为对数值（N ） ，并按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值 (KL)对照组平均活菌浓度的对数值（NO）试验组活菌浓度对数值（NX）7.5.7. 可接受标准：杀灭对数值 (KL)应不低于 3 个对数单位。75%乙醇溶液、0.1% 新洁尔灭
14、溶液消毒效力确认（表面实验）见附表 7。7.6. 消毒效力现场考察试验7.6.1. 目的：确认消毒剂对相应设施的实际消毒效力。7.6.2. 操作：生产车间岗位操作人员按照洁净区操作间清洁标准操作程序 、 洁净区水池、地漏清洁标准操作程序 、 洁净区人员手部卫生清洁标准操作程序 、 洁净区清洁用具清洁标准操作程序 、 洁净区工作服清洁标准操作程序进行清洁消毒。分别选取如下试验现场：7.6.2.1. 冻干车间的配液间（C 级洁净区）顶棚、墙面、地面、工作台面，地漏、水池；7.6.2.2. 冻干车间的灌装间(A/B 级洁净区) 顶棚、墙面、地面、工作台面、设备表面；7.6.2.3. 冻干车间灌装间(
15、A/B 级洁净区)操作人员手部；7.6.2.4. 冻干车间 B 级洁净区的工作鞋、清洁布、拖布。7.6.3. 取样检测7.6.3.1. 消毒 15 分钟后，由 QC 人员到试验现场，按照冻干 C 线洁净区（室）表面微生物监测标准操作程序进行洁净区表面微生物的取样检测；7.6.3.2. 用浸泡或液封方式（地漏、水池、工作鞋、洁净布、拖布）的采用无菌吸管取浸泡液或液封液 1ml，于胰酪胨大豆琼脂培养基平板培养；7.6.3.3. 灌装间(A/B 级洁净区)操作人员，采用 75%乙醇进行手部消毒。将配制好并经过 0.22m 除菌过滤的 75%乙醇盛装于喷壶中，灌装间操作人员在生产开始时进行手消毒，间隔
16、 5 分钟、10 分钟、15 分钟、20 分钟分别进行手指菌取样。7.6.3.4. 连续逐日测定，共测定 3 次。记录测定结果。7.6.4. 可接受标准：所监测的洁净区的微生物均符合各自的洁净级别要求。表面微生物洁净度级别 接触碟 cfu/碟（设备、设施、工作服）5 指手套 cfu/手套A 级 1 17/20B 级 5 5C 级 25 D 级 50 75%乙醇溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表 80.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表 92%甲酚皂溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表 1075%乙醇用于手消毒效果实验记录见附表 117.7. 消毒剂储存有效期确
17、认试验7.7.1. 目的：通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会发生变化，符合要求。7.7.2. 程序：7.7.2.1. 在进行消毒剂有效期确认时，每天开启装消毒剂的容器（具塞磨口玻璃瓶、手消毒器、消毒液喷壶）不少于 3 次，其每次开启时间在 12 分钟，以模拟实际操作的最差条件。7.7.2.2. 分别在消毒剂储存的第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 10 天进行取样，进行消毒剂消毒效力的确认。7.7.2.3. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度 （CFU/ml ） ，并换算为对数值（N） ，并按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值 (KL)对照组平均活菌浓度的对数值（N
18、O）试验组活菌浓度对数值（NX）7.7.2.4. 可接受标准：在消毒液有效期末，杀灭对数值 (KL)应不低于 3 个对数单位。消毒剂储存有效期确认记录见附表 12 8. 结论与评价得出最终结论，并对此验证进行总评价。9. 再验证周期验证小组负责依据消毒剂消毒效果及存放时限验证的情况，拟订消毒剂消毒效果及存放时限再验证周期，报验证委员会审批。当出现以下情况是需立即重新进行验证：9.1. 消毒液浓度发生改变时。9.2. 增加新的消毒液时。9.3. 环境检测中发现新的污染菌，不属于实验中的代表菌属时。9.4. 消毒时间发生变化时。YZ63024 X00，8 /20附表 1 人员培训记录日 期 时 间
19、培训内容 消毒剂消毒效果及存放时限验证方案清洁剂、消毒剂的配制与使用标准操作程序参与人员考核结果记录人 日 期复核人 日 期YZ63024 X00，9 /20附表 2 标准菌种检查确认记录菌种名称 菌种编号 来 源 工作菌种代次 工作菌种保存条件 有效期至金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌可接受标准 1. 标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。2. 使用的标准菌种不能超过第五代。结 论检查人 日 期复核人 日 期YZ63024 X00，10 /20附表 3 试剂/培养基检查确认记录名 称 规 格 供应商名称 试剂批号 失效日期营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基胰酪胨大豆琼脂培养基氯
20、化钠pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液95%乙醇甲酚皂新洁尔灭可接受标准 所有试剂、培养基的规格、数量和保存条件满足要求，且在有效期内；脱水培养基呈流动粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。结 论检查人 日 期复核人 日 期YZ63024 X00，11 /20附表 4 0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认试验组菌落数（cfu/ml ）10-1与消毒剂作用时间 菌种名称1 2 3平均菌落数（cfu/ml）杀菌率金黄色葡萄球菌大肠埃希菌5 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌10 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌15 分钟白色念珠菌稀释级菌种名称 10-3 10-4 10-5平均菌落数（cfu/m
21、l）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌阳性对照白色念珠菌确认结果评价：操作人 日期复核人 日期YZ63024 X00，12 /20附表 5 75%乙醇溶液消毒效力确认试验组菌落数（cfu/ml ）10-1与消毒剂作用时间 菌种名称1 2 3平均菌落数（cfu/ml）杀菌率金黄色葡萄球菌大肠埃希菌5 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌10 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌15 分钟白色念珠菌稀释级菌种名称 10-3 10-4 10-5平均菌落数（cfu/ml）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌阳性对照白色念珠菌确认结果评价：操作人 日期复核人 日期YZ63024 X00，13 /20附表 6 2%甲酚皂溶
22、液消毒效力确认试验组菌落数（cfu/ml ）10-1与消毒剂作用时间 菌种名称1 2 3平均菌落数（cfu/ml）杀菌率金黄色葡萄球菌大肠埃希菌5 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌10 分钟白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌15 分钟白色念珠菌稀释级菌种名称 10-3 10-4 10-5平均菌落数（cfu/ml）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌阳性对照白色念珠菌确认结果评价：操作人 日期YZ63024 X00，14 /20复核人 日期附表 7 75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认（表面实验）杀灭对数平均值（KL ）不锈钢载（min）玻璃载片（ min）镀锌载片（min ）序号消毒剂名
23、称 工作菌液5 10 15 5 10 15 5 10 15金黄色葡萄球菌大肠埃希菌1 75%乙醇白色念珠菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌20.1%新洁尔灭溶液白色念珠菌可接受标准 阴性对照无菌生长；杀灭对数值 (KL)应不低于 3 个对数单位。确认结果评价：YZ63024 X00，15 /20操作人 日期复核人 日期附表 8 75%乙醇溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录平均菌落数监测区域 洁净级别 第一次 第二次 第三次可接受标准 是否合格配液间顶棚 口是口否配液间墙面 口是口否配液间地面 口是口否配液间工作台面C 级25CFU/接触碟.（55mm）口是口否灌装间顶棚 口是口否灌装间墙面 口是口否
24、灌装间地面 口是口否灌装间设备表面 口是口否灌装间工作台面A/B 级A 级：1CFU/接触碟.B 级：5CFU/接触碟.（55mm） 口是口否工作鞋 口是口否清洁布 口是口否拖布B 级5CFU/接触碟.（55mm）口是口否确认结果评价：操作人 日 期YZ63024 X00，16 /20复核人 日 期附表 9 0.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录平均菌落数监测区域 洁净级别 第一次 第二次 第三次可接受标准 是否合格配液间顶棚 口是口否配液间墙面 口是口否配液间地面 口是口否配液间工作台面C 级25CFU/接触碟.（55mm）口是口否灌装间顶棚 口是口否灌装间墙面 口是口否灌装间
25、地面 口是口否灌装间设备表面 口是口否灌装间工作台面A/B 级A 级：1CFU/接触碟.B 级：5CFU/接触碟.（55mm） 口是口否工作鞋 口是口否清洁布 口是口否拖布B 级5CFU/接触碟.（55mm）口是口否确认结果评价：操作人 日 期YZ63024 X00，17 /20复核人 日 期附表 10 2%甲酚皂溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录平均菌落数监测区域 洁净级别 第一次 第二次 第三次可接受标准 是否合格配液间水池 口是口否配液间地漏 C 级25CFU/碟.（55mm） 口是口否确认结果评价：操作人 日 期复核人 日 期YZ63024 X00，18 /20YZ63024 X00
26、，19 /20附表 11 75%乙醇用于手消毒效果实验记录消毒液名称 75%乙醇 配制批号培养基名称 培养基批号 培养温度实验日期 培养时间手指菌测试时间手指菌测试结果（cfu/手套）实验人员 0min 5min 10min 15min 20min结 论检查人 日 期YZ63024 X00，20 /20复核人 日 期YZ63024 X00，21 /20附表 12 消毒剂储存有效期确认记录杀灭对数平均值 KL(天)序号 方法 消毒剂名称 工作菌液3 5 7 10 可接受标准金黄色葡萄球菌大肠埃希菌1 75%乙醇白色念珠菌金黄色葡萄菌大肠埃希菌2 0.1%新洁尔灭溶液白色念珠菌金黄色葡萄菌大肠埃希菌3定量悬浮试验2%甲酚皂溶液白色念珠菌金黄色葡萄菌大肠埃希菌1 75%乙醇白色念珠菌金黄色葡萄菌大肠埃希菌2表面试验0.1%新洁尔灭溶液白色念珠菌阴性对照无菌生长；杀灭对数值(KL)应不低于 3 个对数单位确认结果评价：操作人 日期复核人 日期YZ63024 X00，22 /20
