1、82 中国真菌学杂志2009年4月第4卷第2期Chin j Mycol，April 2009，V0l 4，No2 论著 临床相关毛孢子菌的鉴定及体外药物敏感性研究 郭莉娜 徐英春 窦红涛 万拮 蒋伟 白逢彦 谢秀丽 李若瑜 (1中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科100730；2北京大学第一医院皮肤科，北京 100034；3解放军总医院附属第一医院检验科，北京100037；4中国科学院微生物研究所，北京100080) 【摘要】 目的探讨临床相关毛孢子菌的鉴定方法及对常见抗真菌药物的体外敏感性。方法对48株临床分离的毛孢 子菌分别通过形态学、API 20C AUX、Vitek 2 Co
2、mpact及核糖体rDNA ITS序列分析等方法鉴定到种；采用浓度梯度法(E test)测定氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净对48株毛孢子菌的最低抑菌浓度。结果 形态学和API 20C AUX、Vitek 2 Compact不能准确区分不同种的毛孢子菌，以核糖体rDNA ITS序列分析将48株毛孢子菌鉴定为8个种： 阿萨希毛孢子菌，星型毛孢子菌，皮瘤毛孢子菌，真皮毛孢子菌，皮肤毛孢子菌，赖巴克毛孢子菌， domesticum， jirovecii。 体外药敏结果显示：卡泊芬净对毛孢子菌无体外活性，MIC32 mL；氟康唑和两性霉素B对毛孢子菌活性差，体外活性 最好的药物是伏立康
3、唑和伊曲康唑。结论常规方法不易将毛孢子菌准确鉴定到种的水平，ITS序列分析准确快速，可以 辅助临床区分难鉴定毛孢子菌。毛孢子菌药敏谱不同于临床常见其他酵母菌，氟康唑和两性霉素B对其活性差，伏立康唑 具有良好的体外抗菌活性。 【关键词】毛孢子菌；Etest法药敏试验；鉴定；抗真菌药 【中图分类号】 R 3799 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-3827(2009)02-0082-05 Identification and in vitro antifungal susceptibility of medically important Trichosporon species GUO
4、 Li-na ，XU Ying-chun ，DOU Hong-tao ，WAN Zhe ，JIANG Wei。，BAI Fengyan ，XIE Xiu_1i，LI Ruo-yu (1Chinese Academy of Medical Sciences，Perking Union Medical College，Clinical Microbiology Laboratory，Perking Union Medicall College Hospital，Beijing 100730；2Department of Dermatololgy，Perking University First H
5、ospital，Be ng 100034；3 The First Affiliated Hospital of The General Hospital of the Peoples Liberation Army，Be ng 100037；4Institute of Microbiology， Chinese Academy Sciences，Be ng 100080，China) 【Abstract】0bjective To study the identification method and in vitro antifungal susceptibility of medical T
6、richosporon spp Methods Fortyeight Trichosporon strains were identificated by morphology，API 20C AUX，Vitek 2 Compact and rDNA ITS sequen cingMICs of fluconazole，voriconazole，itraconazole，amphotericin B and caspofungin against Trichosporon sppwere detected by E test methodResults Morphological and bi
7、ochemical methodologies were unable to differentiate the species of Trichosporon sppFol lowing the results of ITSbased identification，there were 8 Trichosporon species，including asahii， asteroids， inkin， dermatis， cutaneum， laibachii， domesticum and jiroveciiThe susceptibility results revealed that
8、casp0flln n had no activi ty against Trichosporon spp(MIC32 gmL)Amphotericin B and fluconzole had poor antifungal activity towards Trichosporon sppThe most efficient compounds in vitro were voriconazole and itraconazoleConclusion Identification of Trichosporon sppby conventional methods is often dif
9、ficult and inconclusiveITSbased molecular procedures can provide alternative and more useful methods for characterization and identification of Trichosporon sppThe susceptibility patterns of Trichosporon sppdiffer largely to other yeastsAmphotericin B and fluconazole show poor antifungal activityVor
10、iconazole and itraconazole seems to be the most effee tive agents in vitro 【Key word】Trichosporon；Etest method；identi cati0n；antifungal dmgs Chin J Mycol，2009，4(2)：8286 近年来，随着免疫低下宿主的增多，临床上真 基金项目：卫生部公益性行业科研专项基金(200802026) 作者简介：郭莉娜，女(汉族)，硕士研究生在读E-mail：guo0201205 126eom 通讯作者：徐英春，E-mail：xycpumchyahoocon
11、en 菌感染的发生越来越普遍。除念珠菌以外，一些少 见真菌，如毛孢子菌、镰刀菌、接合菌等引发的感染 亦呈日渐增多趋势。毛孢子菌不仅引起浅部感 染，如毛发、指甲、皮肤的白毛结节病，还易导致血 中国真菌学杂志2009年4月第4卷第2期Chin J Mycol，April 2009，Vol 4，No2 液恶性肿瘤、大面积烧伤及AIDS等免疫缺陷患者 的系统性感染，且预后较差。 近来的分类学研究表明 J，白吉利毛孢子菌是 由6种不同的毛孢子菌组成，分别为阿萨希毛孢子 菌( asahii)、粘质毛孢子菌( mucoides)、星 形毛孢子菌( asteroids)、皮瘤毛孢子菌( inkin)、皮肤毛孢
12、子菌( cutaneum)及卵形毛孢 子菌( ovoides)。其中，阿萨希毛孢子菌和粘质 毛孢子菌常导致深部感染，星型毛孢子菌和皮肤毛 孢子菌易引起浅部感染，而皮瘤毛孢子菌和卵形毛 孢子菌与头部及生殖器白毛结节病有关。值得注 意的是，引发感染的毛孢子菌种类在增多 J。 本文就临床所收集的48株毛孢子菌的鉴定方 法以及对常见抗真菌药物体外敏感性做一探讨。 1材料与方法 11试验菌株 48株毛孢子菌分别来自于北京协和医院检验 科16株、北京大学第一医院皮肤科真菌实验室19 株、解放军总医院第一附属医院检验科1O株、江苏 省人民医院检验科1株、中国医科院皮肤病学研究 所1株及中科院微生物所1株，标
13、准菌株：近平滑 念珠菌ATCC22019。 12试剂 API 20C AUX(法国生物梅里埃公司)；Vitek 2 Compact(法国生物梅里埃公司)；氟康唑、氟立康 唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净Etest试条 (瑞典AB BIODISK公司)；沙堡弱培养基(英国 OXOID公司)；RPMI1640培养基(Invitrogen公司) 含15BACTO琼脂，2葡萄糖和4MOPS缓冲 液。 13菌种鉴定 显微镜下形态 在SDA平皿上28培养24 48 h，乳酸酚棉兰染色涂片可见关节孢子、菌丝、 假菌丝、芽生孢子。 编码鉴定API 20C AUX取新鲜菌落(SDA 平皿上28C培养24 h，
14、生长缓慢者48 h)，用0 85无菌盐水制备浊度相当于20麦氏浊度单位 (MCF)菌悬液，按照说明书操作。Vitek 2 Compact 取新鲜菌落(SDA平皿上28C培养24 h，生长缓慢 者48 h)，用附带的045无菌盐水制备成18 22 MCF菌悬液，按说明书操作。 rDNA ITS序列分析玻璃珠震荡法 提取基 83 因组DNA，真菌通用引物扩增rDNA的ITS区，包 括ITS1、58S、ITS2。通用引物序列ITS1：5 TCCG TAGGTGAACCTGCGG 3 ：ITS4：5 TCCTCCGCTrAT TGATATGC 3 ，PCR反应体系参考文献 。PCR 产物送上海生物工程
15、公司双向测序，将所测得的毛 孢子菌的rDNA ITS序列，在Genebank核酸序列数 据库(http：wwwncbinlmnihblast)中进行同 源性搜索。毛孢子菌属内ITS序列同源性很高，一 般认为同种毛孢子菌不同菌株间差异1_6 J。 14药敏试验 取SDA平皿上28培养24 h(生长缓慢者48 h)新鲜菌落，用085无菌盐水制备浊度相当于 05 MCF菌悬液，用无菌棉拭子蘸取菌液在RPMI 1640固体培养基上分3个方向密涂，放置15 min 待表面干燥后贴Etest试剂条，28孵育4872 h 读数。 15结果判读 药敏结果氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑及卡 泊芬净读80抑制时浓度为
16、最低抑菌浓度MIC；两 性霉素B读100抑制时浓度为最低抑菌浓度 MIC。 鉴定结果鉴定正确为鉴定菌株属名种名均 与测序结果相同；属对种错为鉴定菌株属名正确， 种名错误；鉴定错误为鉴定菌株属名种名均错误或 者无法鉴定者。 16质控 根据美国临床与实验室标准化委员会 (CLSI)，选取ATCC 22019近平滑念珠菌为质控菌 株，氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B和卡 泊芬净对标准菌株药敏质控允许的MIC范围及药 敏质控试验结果见表1。 表1 5种抗真菌药对ATCC 22019参考菌株的质控允许的 MIC范围及药敏质控试验结果( gmL) Tab1 Acceptable limits and
17、 results of MlCs of 5 antifungal agents for quality control strain ATCC22019 84 2结 果 中国真菌学杂志2009年4月第4卷第2期Chin J Mycol，April 2009，Vol 4，No2 21鉴定结果 以ITS序列分析鉴定结果为标准，48株毛孢子 菌共包括8个种，分别为36株阿萨希毛孢子菌 ( asahii)，2株星型毛孢子菌( asteroides)，1 株皮瘤毛孢子菌( inkin)，1株真皮毛孢子菌 ( dermatis)，1株皮肤毛孢子菌( cutaneum)，1株赖巴克毛孢子菌( laibach
18、ii)， 4株 domesticum及2株 firoveciiAPI 20C AUX或Vitek 2 Compact只能鉴定阿萨希毛孢子菌 ( asahii)、粘质毛孢子菌( mucoides)及皮瘤 毛孢子菌( inkin)，这3种之外的其他毛孢子菌 则无法鉴定。具体鉴定结果见表2。 表2 API 20C AUX和Vitek 2 Compact对毛孢子菌的鉴定结果比较(以ITS鉴定结果为参考) Tab2 Evaluation of API 20C AUX and Vitek 2 Compact to identify Trichosporon sppbased on ITS analysis
19、 株数 析鉴定的菌株 鉴定正确 属对种错 鉴定错误 鉴定正确 属对种错 鉴定错误 asahii asteroides inkin dermatis cutaneum laibachii jirovecii domesticum 鉴定准确率 0 1 O O O 0 0 1 6660 O 1 0 1 O l O 5420 22药敏结果 除一株皮肤毛孢子菌(ATCC28592)外，卡泊 芬净对其他47株毛孢子菌无体外活性，MIC32 IxgmL；氟康唑和两性霉素B对35株阿萨希毛孢 子菌活性差，MIC 。分别为24 gmL和2 mL、 MIC9o分别为256 p,gmL和64 pgmL；1株真皮毛
20、孢子菌对氟康唑MIC256 pgmL，2株星型毛孢 子菌对两性霉素B有高MIC值。伏立康唑和伊曲 康唑对所有受试毛孢子菌有较好的活性，MIC帅分 别为3 pgmL和32 pgmL，特别是对氟康唑耐药 的阿萨希毛孢子菌，氟立康唑有很好的体外抗菌活 性；48株毛孢子菌MIC值分布，如表3所示。 3讨 论 毛孢子菌属(Trichosporon spp)属于真菌界、 担子菌门、银耳钢、银耳目，广泛存在于自然界中。 人体感染毛孢子菌主要通过内置导管、引流管、烧 伤或者微生物从肠黏膜移植而来。毛孢子菌鉴定 存在的问题是，难以根据形态学或编码鉴定法将其 与其他酵母菌区别开来。本研究结果表明API 20C A
21、UX或Vitek 2 Compact只能鉴定阿萨希毛孢 子菌、粘质毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌，对这3种之 外的其他毛孢子菌无法鉴定。 Carolina Serena 等通过微量肉汤稀释法测定 了10株阿萨希毛孢子菌对8种抗真菌药物的MIC 值，对氟康唑MIC64 p,gmL，其中6株毛孢子 菌对两性霉素B的MIC1gmL。临床用两性 霉素B或氟康唑或两者联合治疗毛孢子菌感染失 败与体外药敏结果相一致 j。本研究中的大多数 阿萨希毛孢子菌菌株对氟康唑和两性霉素B的体 外敏感性也较差。 本研究显示伏立康唑和伊曲康唑对毛孢子菌 具有良好的体外活性，特别是伏立康唑MIC帅为3 p,gmL。Fourneir
22、等用伏立康唑成功治愈1例骨髓 l O O l O 2 2 O 1 O 0 0 O O O O O O O O O 2 ， 2 4 镐 中国真菌学杂志2009年4月第4卷第2期Chin J Mycol，April 2009，Vol 4，No2 表3 5种抗真菌药对48株毛孢子菌的体外药物敏感性试验结果(IxgmL) Tab3 In vitro susceptibility results of 5 antifungal drugs to 48 Trichosporon isolates( gmE) 85 菌株类型 株数 氟康唑 伏立康唑 伊曲康唑 两性霉素B 卡泊芬净 注：CBS即Centraa
23、lbureau voor Schimmelcultures，ATCC即American Type Culture Collection，CMCC即中国医科院皮肤病学研究所菌种收 藏中心，CGMCC即中国普通微生物菌种保藏管理中心 瘤继发阿萨希毛孢子菌播散性感染患者 。另有 报道豚鼠实验模型表明伏立康唑比两性霉素B更 能有效延长豚鼠生存期并减少脏器负担 。 早有报道卡泊芬净对毛孢子菌、新生隐球菌及 镰刀菌属无体外活性 ，本研究中卡泊芬净对 98菌株MIC32 p,gmL。近来有报道，两性霉素 B联合米卡芬净对毛孢子菌感染有一定的疗 效。 以往对酵母菌的鉴定主要通过形态学和生化 反应，近2O余年来
24、，新的不常见的机会性真菌感染 在增多，使得传统鉴定手段越来越不能满足临床上 的需要。分子生物学技术由于敏感性高和特异性 好，能区分只有几个碱基差异的不同种，在微生物 鉴定中得到了广泛的应用。真菌通用引物PCR扩 增核糖体rDNA的ITS或IGSI进行序列分析，可快 速而准确地鉴定菌种。目前常用的有关酵母菌的 药敏试验M27一A2方案的受试菌并不包括毛孢子 菌，更没有药敏判断折点可用，体内研究也多停留 在动物模型阶段，所以关于毛孢子菌的体外药敏试 验有待进一步研究。 参考文献 2 3 4 5 6 7 8 9 1Walsh TJ，Groll A，Hiemenz J，et a1Infections
25、due to emerging 10 and uncommon medically important fungal pathogensJClin Microbiol Infect。2004，10(Suppl 1)：48舶 Gueho E，Smith MT，de Hoog GS，et a1Contributions to a revi sion of the genus TrichosporonJAntonie Van Leeuwenhoek， 1992，61(4)：289-316 Francisco MM，Dan HB，Eoin PC，et a1Disseminated Trichos- p
26、oronosis Caused by Trichosporon loubieriJJ Clin Microbi ol，2003，41(1 1)：5317-5320 J萨姆布鲁克，Dw拉塞尔著黄培堂译分子克隆实验 室指南，第3版M北京：科学出版社，2002：485-487 李厚敏，刘伟，万哲，等临床相关毛孢子菌生物学特性的研 究J中华检验医学杂志，2005，28(6)：613-616 Takashi S，Akemi N，Reiko I，et a1Identification of medically relevant Trichosporon species based on sequences
27、 of internal transcribed spacer regions and construction of a database for Trichosporon identificationJJ Clin Microbiol，1999，37(6)： 1985一l993 Carolina S，Francisco jP，Montserrat O，et a1In vitro antifungal susceptibilities of uncommon Basidiomycetous yeastsJAnti microb Agents Chemother，2004，48(7)：2724
28、2726 MorettiBranchini ML，Fukushima K，Schreiber AZ，et a1 Trichosporon species infection in bone man w transplanted pa tientsJDiagn Microbiol Infect Dis，2001，39(3)：161164 Fourneir S，Parageau W，Feulillhade M，et a1Use of voriconazole to successfully treat disseminated Trichosporon asahii infection in a
29、patient with acute myeloid leukemiaJEur J Clin Micro biol Infect Dis2002，21(12)：892-896 Carolina S，Fe lix G，Marc al M，et a1Efficacy of voriconazole in a guinea pig model of invasive TrichosporonosisJAntimicrob 86 中国真菌学杂志2009年4月第4卷第2期Chin J Mvcol，April 2009，Vol 4No2 Agents Chemother，2006，50(6)：224022
30、43 1 1Joseph R，Cheryle GTCaspofungin：the first agent available in the echinocandin class of antifungalsJProc(Bayl Univ Med Cent)，2002，15(1)：97-99 12 Carolina S，Mar Rodn guez M，Marc al MCombined therapies in a murine model of BlastoschizomycosisJAntimicrob A gents Chemother，2007，51(7)：2608-2610 收稿日期
31、本文编辑 2008 8一l5 王飞 消 息 北京大学真菌与真菌病研究中心CBS真菌生物多样性中心联合举办 医学真菌学培训班 当前，引起真菌病有关的真茵谱在迅速扩大，这主要是由于艾滋病、白血病、器官移植或大手术导致的 重度免疫缺陷病人的激增，真菌感染是导致这些病人死亡的根本原因。对病原真菌的正确鉴定是提高真 菌病诊断水平的关键。国际著名的CBS真菌生物多样性中心与北京大学真菌中心将在北京联合为临床医 生、临床微生物学家、实验室技术人员和研究生提供医学真菌学培训课程。课程主办人是国际人和动物真 菌学会主席，著名医学真菌学家Sybren de Hoog教授，同时邀请了多位国内外著名的真菌学家为本培训
32、班 授课。主要讲授致病性、机会性霉菌和酵母茵的鉴定；将有大量有代表性的病原茵供学习和实习。学习班 采用教学式授课，有无医学真菌方面的经验均可参加学习。特殊课题的讲座将涉及分离技术；天然和获得 性免疫受损的病人真菌群落；分子生物学和与动物相关联真菌的自然生态学。临床方面主要详细讲授真 菌病的诊断和治疗。 负责人：GSde Hoog(CBS，The Netherlands)，RYLi(Research Center for Medical Mycology，Peking Uni- versity，China)，RGVitale(Buenos Aires，Argentina) 讲者：GSde Hoo
33、g(CBS，The Netherlands)，YGraeser(Berlin，Germany)，RGVitale(Buenos Aires，Ar gentina)，JAfehra(Buenos Aires，Argentina)，KNishimura(Chiba University，Japan)，GBulmer(Peking U- niversity，China)，DMLi(李冬梅，Georgetown University，USA)，白逢彦(中科院微生物研究所研究员)， 王龙(中科院微生物研究所副研究员)，刘维达(中国协和医科大学、医科院皮肤病研究所教授)，温海 (第二军医大学长征医院教授)
34、，冉玉平(四川大学华西医院教授)，李春阳(山东大学齐鲁医院教授)， 席丽艳(中山大学第二医院教授)，马琳(首都医科大学北京儿童医院教授)，曾敬思(武汉华中科技大学 协和医院副教授)，黄晓军(北京大学血液病研究所教授)，安友仲(北京大学人民医院ICU教授)，肖永红 (北京大学临床药理研究所教授)，李若瑜(北京大学真菌和真茵病研究中心教授)，李东明(北京大学真 菌和真菌病研究中心副教授) 教学辅助人员：万哲(北京大学真菌和真菌病研究中心)，王晓红(北京大学真菌和真菌病研究中心)， 尚盼盼(北京大学真菌和真菌病研究中心) 授课语言：汉语、英语(个人解说和指导可以用汉语) 所用资料：(Atlas of Clinical Fungi)2009年第三版(第一作者Gsde Hoog)，每位学员将得到一套本书光盘 颁发证书：CBS培训证书，国家级CME学分证书10分 培训费用：3 000元人(包含资料和光盘费用，不包含食宿) 培训时间：2009年6月110日 培训地点：北京大学医学部 联系电话：010-65041809 电子邮箱：isham2009fungalinfeetioncn 住宿酒店：北京赢家商务酒店(北京海淀区学院路38号，01082320101)
