1、JAK2 基因突变的发现改变了骨髓增殖性肿瘤的分类和诊断朱平（北京大学第一医院）从 2005 年报道 JAK2 V617F 突变发生于慢性骨髓增殖性疾病（ myeloproliferative disorder，MPD）1-3以来，这个基因突变的发现改变了 MPD 的分类和诊断。以往 MPD 包含慢性粒细胞白血病（CML），真性红细胞增多症（PV），原发性血小板增多症（ET），和原发性骨髓纤维化（PMF）,慢性中性粒细胞白血病（CNL），慢性嗜酸细胞白血病/ 高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）等多种疾病。在修订的 2008 WHO 分类系统中，有无 JAK2 突变成为 MPD 主要的诊断指标
2、4，例如，如果 JAK2 突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增生可以诊断 PV，即使血红蛋白低于以往 WHO 规定的指标值，但却持续超过正常值 20g/L 的 PV 也可以确诊。如果 JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于 450X109/L,骨髓巨核细胞增生，可以诊断 ET。不仅 MPD 的诊断发生革命性进展 5，连名称都改变了。MPD 改称为骨髓增殖性肿瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN)，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)称为MDS/MPN。新分类的 MPN 中还包含了肥大细胞
3、病（MCD）。而以前的慢性嗜酸细胞白血病/ 高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）分别重新划分为 CEL，HES 和有 PDGFRA, PDGFRB 或者 FGFR1 基因异常的嗜酸细胞增高症 3 种 MPN，并强调这类疾病的本质是肿瘤。现已明确，MPN 具有共同的干细胞起源的克隆型遗传特征，临床出现不同表型是突变影响的蛋白、酪氨酸激酶及相关分子的不同构型和异常的信号转导所造成的。2008 年 WHO 修订 MPN 诊断标准的依据是多数患者都具有 JAK2 突变，主要是 JAK2 V617F, 还有 JAK2 外显子 12 突变。由于 JAK2 V617F 是髓系细胞特异性的，在 PV 以外其他原
4、因造成的红细胞增多症并不出现，因此是 PV 的一个敏感的诊断标记。髓系肿瘤中 JAK2 V617F 并非 PV 独有， 还可见于 50%的 ET 或 PMF。但其他髓系肿瘤 JAK2 V617F 发生频率很低，淋巴系肿瘤不出现。仅检测 JAK2 V617F 突变虽然不能单独用来区分不同类别的 MPN，但是结合骨髓活检的组织学依据，可以诊断 ET 和 PMF，排除反应性的血小板增多和骨髓纤维化。JAK2 突变在 PV 诊断中意义最大，我们近 2 年临床遇到的 PV 几乎都有突变，查不到突变是偶然的情况。诊断 ET 或 PMF 时则可能未发现 JAK2 V617F，原因除了大约一半患者的确无突变外
5、，还因为目前的检测方法并没有标准化 6。应用直接测序、位点特异性 PCR 和荧光定量 PCR 检测JAK17F 基因突变的方法会出现一些差异 7,8。不同方法的检测灵敏度不同，突变检出率可能不同。通常直接测序检测的灵敏度约 20-25%，位点特异性 PCR 方法约 1-3%，荧光定量 PCR 方法约 0.5-5%。我们的部分初诊患者血细胞携带突变的比例可低至 1%，使用较高灵敏度的检测方法可提高突变的检出率。在 ET 和 IMF 患者中突变和红细胞增多、瘙痒等类似于 PV 的症状相关 9，提示突变阳性的MPD 中有可能有共同的类似于 PV 的发病因素 10,11 。携带纯合型还是杂合型等位基因
6、以及突变细胞的比例都与临床症状有关，对 MPD 并发症的发生率及预后都有重要意义 12。PV 患者较 ET 或 IMF患者更多携带纯合型突变细胞 13 。临床工作对患者杂合型/ 纯合型突变克隆的携带情况，突变比例的定量检测也越来越重视。转染 JAK2 V617F 突变基因的小鼠模型可出现类似 PV 的表型，突变基因表达量进一步增高时可以进展为骨髓纤维化，而在突变基因低表达的小鼠模型中可以观察到一过性的血小板增多 14。MPD 疾病过程中临床症状和 JAK2 V617F 突变携带比例的变化很可能与杂合型突变向纯合型突变的基因转变有关 15。JAK2 基因突变的发现也导致其他临床诊断指标的变化。P
7、V 患者血红蛋白增加或者血细胞容积增加是诊断重要的指标，但并非总是和体内红细胞总量真正增加（红细胞增多症）相一致 16。PV有时候可以表现为红细胞压积正常，是因为血浆也相应增加了，尤其是明显脾肿大时（PV 通常不明显）。既然如此，那么在经典 MPN(PV, ET 和 PMF)血红蛋白和血细胞容积也不一定有明显区别。过去 PV 专业协作组（PVSG ）建议在诊断 PV 时使用红细胞总量 (RCM) 来克服上述缺点，然而这些建议主要基于概念而非证据，2001 年的 WHO 标准开始强调要做骨髓活检来帮助诊断。既然几乎所有 PV 患者有 JAK2 突变，检测 RCM 来区分 PV 和继发性红细胞增多
8、就意义不太大了，外周血JAK2V617F 检测是当前 PV 患者首选的检查 17。与此同时，应当鼓励检测血清 Epo 水平，真正的PV 同时出现 JAK2 V617F 阴性和 Epo 水平正常或增加的可能性非常小，血清 Epo 水平检测能够发现极少见的 JAK2 V617F 阴性的 PV。另一方面，也应该考虑检测 JAK2 V617F 阴性，血清 EPO 水平正常或者低下患者的 JAK2 外显子 12 突变和骨髓活检。骨髓细胞学变化也是 ET，PMF 和 JAK2突变阴性的 PV 必须的诊断标准之一。因为 JAK2 V617F 见于 50% 的 ET 或 PMF，诊断血小板增多和骨髓纤维化患者
9、时应考虑 JAK2突变。突变出现可以排除反应性骨髓增殖，然而没有检出突变并不能排除 MPN 的可能性。诊断 ET和 PMF 时通常也需要骨髓检查。有时候，PV 和 JAK2 V617F 阳性 ET/PMF 之间的区别不明显，如何诊治存在一定问题。我们建议严格按照 2008 WHO 标准作出诊断，密切监测患者，抓住任何重要的变化，确保及时修正诊断。同样，ET 或 PMF 类似 CML 时也应该重视，尤其是在未发现 JAK2 V617F 时，在骨髓检查之初就要考虑细胞遗传学检查。如果没有发现 Ph 染色体，但是骨髓有小巨核细胞时，应考虑做 FISH 检测 BCR-ABL 基因。诊断不典型 MPN
10、(CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分类的 MPN)时，通常要求 BCR-ABL 阴性, 有红系造血异常，粒细胞发育异常，或者单核细胞发育异常（1x109/L）。如果外周血白细胞25x109/L 伴随80%分叶核中性粒细胞或带状中性粒细胞，不成熟粒细胞10%和原始粒细胞1%（骨髓中5% 原始细胞）时，考虑 CNL。如果发现骨髓形态学异常的肥大细胞聚集，怀疑MCD 的时候，应当考虑类胰蛋白酶染色检查骨髓，做流式细胞仪分析寻找形态异常的肥大细胞 (CD25 阳性), 如果有可能最好进行 KIT D816V 突变检测。当临床表型和经典的或者其他非经典的MPN 的诊断标准不符时候，可考
11、虑不能分类的 MPN。嗜酸细胞增多时考虑 CEL-NOC 或 HES。CEL-NOC 包含伴有嗜酸细胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和 FGFR1 重排的髓系肿瘤。诊断两者都需要外周血嗜酸细胞计数1.5x109/L，排除继发性嗜酸细胞增多，排除其他急慢性髓系肿瘤，并且没有表型异常和/或克隆性 T 淋巴细胞。诊断 HES 需要没有细胞遗传学异常，外周血原始细胞 2%或骨髓原始细胞5%两个条件。 基因检测在疾病诊断中愈来愈重要，从 1960 年在 CML 中发现了 Ph 染色体时开始， 除 Ph 染色体的特征性 BCR-ABL 基因，陆续在 PV, ET 和 PMF 中发现 JAK2 V617
12、F，PV 中 JAK2 外显子 12突变；在 ET 或 PMF 中发现的 PLW515L/K，在伴有嗜酸细胞增多症的髓系恶性肿瘤中发现的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1 基因重排，在 MCD 中发现的 KITD816V 和其他 KIT 突变，在幼年型粒单细胞白血病（JMML）中的发现 RAS 通路突变（包括 RAS, PTPN11 或者 NF1）。这些与髓系恶性肿瘤发病相关的基因的发现，最终将导致一些新分类和诊断方式。例如，检测 FIP1L1- PDGFRA 突变( 用 FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排(用染色体核型或 FISH)，或者 FGFR1 易位 (用染色
13、体核型) 都是目前原发性嗜酸细胞增多症分类及选择治疗方案的必要检查。抑制 JAK2 基因来治疗 MPN 的药物也在积极的研制中，抑制 JAK2 基因表达 18的药物 TG101209, Go6976, erlotinib 都有临床应用的可能性。参考文献1. James C, Ugo V, Le Coudic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, 2005,434:1144-1148.2. Zhao R, Xing
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