1、真核生物基因转录调控研究 的进展和方法,周 建 林,一、真核生物基因表达调控的特点(略)二、真核生物基因转录调控三、真核生物基因转录调控的研究方法,转录水平的调控,顺式作用元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting factor),顺式作用元件,是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因非编码序列分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘子,反式作用因子trans-acting factor,概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列,而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(
2、阻遏) 。 类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导转录因子,启动子(Promoter),概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件 。,一个基因可同时拥有一个及以上启动子；一般在转录起始点上游, 位于(+1)及5端上游100200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素。 ；可与增强子共同控制转录起始和强度；发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。,1.核心启动子：RNA pol转录起始所必须的最少的DNA序列，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。,2.上游启动子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始
3、转录点更远的上游元件。 与TFD结合成复合物后提高转录频率。,启动子的研究方法,研究内容：1、 转录起始位点的确定 2、启动子区域（顺式作用元件）的确定 3、转录因子（反式作用元件）结合位点的确定 4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用对基因转录的影响,1、转录起始位点（TSS）的确定,生物信息学预测TSS,5-RACE初步确定TSS的大概位置,引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位TSS,推荐使用Gene2Promoter 软件（ http:/www.genomatix.de）和TSSW、TSSG（http:/ （ http:/www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）,/
4、,FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion) GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen ),SMART RACE cDNA Amplification (Clontech),Primer extension(引物延伸),S1 nuclease mapping,RNA 5,DNA 3,*,5,3,RNA 5,DNA 3,5,3,PAGE Analysis,Add S1 nuclease,Primer extension and S1 nuclease digestion,2、启动子区域的确定,生物信息学预测启动子区域,缺失突变,荧光素酶活性分析
5、,克隆5 -flanking sequence并连接到报告基因载体上,确定转录调控区域（启动子区域）,Deletion mutagenesis (缺失诱变),Reporter vector,3、转录因子结合位点的确定,(1)生物信息学预测转录因子结合位点 (2)实验证实转录因子结合位点：,EMSA/gel-shift, super shift ChIP DNase I footprinting,推荐使用MatInspector 软件（ http:/www.genomatix.de）,Mapper http:/bio.chip.org/mapper/mapper-top Jaspar http:
6、/ for evolutionary conserved transcription factor binding sites.,rVista 2.0 (http:/rvista.dcode.org/) ConSite (http:/ ),Gel retardation(凝胶阻滞)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 电泳迁移率变动分析),ChIP （染色质免疫共沉淀）,4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录的影响,（1）定点突变荧光素酶活性分析,（2）过表达转录因子测定目的基因的表达,（3）干扰转录因子的表达测定目的基因的表达,（4）转基因
7、动物,定点突变,增强子（enhancer）,基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复序列。 增强子特性1.增强效应非常明显 10200倍 。2.与其位置、取向无关（上下游、距离）3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须4.有细胞组织特异性， 需与特异蛋白因子作用5.无基因特异性 6. 要有启动子才能发挥作用,Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557,Models for Enhancer Action, consists of several good binding sites of
8、 TFs the sites are spatially clustered together the pattern of sites is conserved,Characterization of an enhancer?,Enhancer Element Locator http:/www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/,Assays for Enhancers,Transient transfection DNAase I hypersensitivity DNAase I footprinting/mutation analysis Transgenic m
9、ice,Transient Transfection:,P,Luciferase,E,P,Luciferase,E,P,Luciferase,Insulator (绝缘子),一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。,3.7,Insulator function in Imprinting,Two linked Imprinted Genes: Maternal H19 (on), Igf2 (off) Paternal H19 (off), Igf2 (on),H19,Igf2,Effects of insulators on enhance
10、rpromoter interactions,CTCFBSDB: a CTCF binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators : http:/insulatordb.utmem.edu/,CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity,CTCF vs. BORIS,CTCF 11个与DNA结合的锌指结构域 与绝大多数的ICRs以及CpG岛结合 结合是甲基化敏感的 具有绝缘子功能 具有边界元素的功能，例如阻断异染色质的传播 保护相应区域不被甲基化 广泛表达，尤其在精母细胞中表达量高 过表达抑制细胞的增殖 基因定位于16q22, 在癌症中常发生突变或缺失,BORIS 11个与DNA结合的锌指结构域 结合位点与CTCF显著重叠 ？ ？ ？在癌症中被重新激活 通常仅在睾丸中表达过表达促进细胞的增殖. 基因定位于20q13, 在癌症中常发生扩增,Thank you!,
