1、病理组织制片和染色技术,张进华,一、前 言病理组织制片和染色技术是病理学的重要组成部分，病理的教学、科研、临床活检、尸解检验、诊断等都离不开制片染色技术工作。因此，组织的制片和染色技术是研究病理学的重要的方法和手段之一。,近年来病理技术不断发展，如特殊染色、组织化学、免疫组织化学（免疫荧光组织化学、免疫酶组织化学）细胞培养、原位分子杂交、放射自显影、原位PCR技术等在广泛的应用和提高，大大促进了病理学科的发展，把病理学推进了一个新的领域，但这些新技术也都建立在病理组织制片或染色基础上，所以要认识制片和染色技术的重要性，不但要学习新技术，更要掌握这一传统的病理技术，共同推向病理学科的发展。,组织
2、制片技术的应用，从1665年由Hook发现细胞开始已300多年历史，最早应用冰冻切片随后又发展了石蜡切片，后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡（聚乙二醇）、塑料、包埋组织而制作切片。,从而观察不同的组织、细胞的形态结构，以及细胞内某些化学成份含量变化。,各种组织制片成切片标本，须要经过一个比较繁多的过程，现将制作切片的主要程序和制片的种类，介绍：,组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、烤片、脱蜡、各级酒精、水洗、常规染色、脱水、透明、树胶封固。,石蜡制片程序,冰冻制片程序,组织取材、冰冻切片、干燥粘片、固定、染色、脱水、透明、树胶封片。,非切片 （了解内容） 1 整体封藏法低等动物自身薄
3、片如：鱼鳞片、蛙胚。 2 涂片法如：血液、精液、痰、胸腹水等 3、磨片法主要用有钙盐坚硬材料，牙齿、介壳、坚骨手工磨 4 分离法a、压片法动终板的制备b、撕碎法c压碎法,二、取材（实验病理、临床病理、尸解诊断）,1、实验病理取材 动物的杀死：动物杀死方法很多，根据动物大小、种别、观察目的而定。,A：断头法：青蛙、小鼠等较小的动物 B：空气栓塞法：兔猫（2040ml）狗100ml C：麻醉法：乙醚、氯仿、4%巴比妥作V注射1ml/1kg，20%氨基甲酸乙酯（尿烷）作腹腔注射5ml /1kg D：击头法：大鼠,E：放血法：眼球放血（小鼠） 股动脉放血，大动物： 牛、猪原则：要尽避免使动物长时间陷入
4、痛苦和濒于死亡状态，以免疫组织成份，结构发生变化，引起病理假象。,(1) 取材时所用的刀要锐利，动作仔细，不可来回切割，勿使组织受挤压。(2) 注意组织，器官的切面：肾脏纵切脑（表面和脑沟成直角）垂直切肝脾横纵均可,（3） 保持组织清洁：血液，污物， 粘液，食物用生理盐水洗净。（4） 保持标本新鲜：动物死后立即固定。(5) 切取组织大小：0.50.50.2cm1 1 0.3cm1.51.50.5cm,2 . 临床活检取材：注意事项： （1） 申请单位姓名与标本一致，防止混乱差错。 （2） 检查标本是否符合要求干涸坏变，固定液多少。 （3） 取材时描写：大小，形态，色泽，硬度等。 （4） 芝麻或
5、针帽大小组织染伊红？：镜纸包好 （5） 常见肿瘤取材方法：略。,3. 尸体解剖组织（脏器）取材：略。,三固定（ fixalion）固定：新鲜组织浸泡在适宜的化学试剂内借助于化学试剂的作用，使组织或细胞内蛋白质凝聚，沉淀，成为溶性并保持组织细胞原有的形态结构：称为固定。所使用的化学试剂配成的溶液，称为固定液。,1. 固定的目的(1) 迅速防止组织细胞死后自溶和腐败（组织失氧释放溶酶体酶溶解组织） (2) 固定或沉淀细胞内或组织液中蛋白，脂肪，糖原，无机盐和色素，使其不被溶解和消失。 (3) 使组织硬化，有一定弹性抵抗以后的脱水，透明，使组织发生扭曲，变形。,(4) 某些传染性标本，能防止疫病的扩
6、散。（如结核等）(5) 保存细胞内固有的物质：如包含体，线粒体，溶酶体等。(6) 可增强染色作用(7) 有利于各种细胞折光率。(8 ) 固定后能产生良好的反差。,2、固定的注意事项：(1) 必须及时固定：夏天4h冬天24h就自溶。(2) 固定液的用量：标本体积1015倍。(3) 固定时间：根据组织不同的种类、性质大小、固定液的种类而定。(4) 固定用的容器要足够大，一般标本缸，广口瓶,4、固定液的分类、配制和特性（1）分类 A：凝固性酒类、丙酮、氯化汞等 非凝固性甲醛、戌二醛等 B：醛类甲醛、戌二醛 氧化剂类重铬酸钾、高猛酸钾 蛋白质变性酒精、苦味酸 C：单纯固定液-10%甲醛 95%乙醇 混
7、合固定液-Boons Conroys,(2)常用固定液的配制及性质： A：10%甲醛-应用广泛 (注：36-40%作为活检、尸解、一般形态学观察常用) 优点：刺激性气味、对组织渗透力强、固定均匀、能保存脂类（神经、髓鞘、高尔基体、线粒体、糖类保存）价格便宜、配制简单、使用方便。 缺点：固定久产生色素 图附,10%中性甲醛(ph7.3-7.6) 浓甲醛100ml 自来水900ml 加碳酸钙至饱和ph7.3-7.6 (组织化学、免疫组化、保存抗原) 10%中性缓冲甲醛(ph7.0) 浓甲醛100ml 蒸馏水900ml NaH2 po4H2o 4g Na2Hpo4 6.5,B： 酒精 优点：固定又脱
8、水：保存糖原，尿酸盐。（脱落细胞、培养细胞也常用） 缺点：渗透力强-组织表层固缩,C：丙酮：用于酸的固定(磷酸酶、胰酶、氧化酸)收缩剧烈，挥发、易燃、与水、醇、氯仿、醚混合,混合固定液 FAA：浓甲醛100ml 95%酒精850ml 冰醛醋58ml (收缩小、核染色质固定好) Boulns液：苦味酸饱和液75ml 浓甲醛 75ml 冰醋酸 5ml (对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、肌健、结缔组织较好 ),3、固定的原理,甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。,P,CONH+HCH+P-CONH,O,P,-CON-C-P-CON,H,H,亚甲基桥,肽键,甲醛,蛋白质分子之进
9、行交换，形成亚甲基桥，把蛋白质分子串联起来，使蛋白变性，破坏了蛋白质的立体结构，达到固定目的。,四、洗涤组织在固定后，一定要把渗透到里面的固定液(沉淀物或结晶)洗去，然后再进行下一步程序，洗涤必须彻底，否则留在组织中的固定液有可能妨碍染色。,洗涤的原则： 1、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要冲洗。 2、固定液为水配制者，用水流水冲洗 3、凡含有铬酸、重铬酸钾的固定液-洗涤 4、含有苦味酸用乙醇配制的固定液-洗涤,5、含有氯化汞固定液-冲洗-碘液去汞(zenkers)-5%硫化硫酸钠去碘 6、洗涤时间大动物组织8h以上、小动物组织2-8h 洗涤方法：流水冲洗,五、脱 水 脱水就是利用某些化学试剂
10、与水混合内的水份彻底脱除。 要求：1、脱水剂能与水任何比例混合2、脱水剂也能与透明剂混合3、脱水要彻底否则无法进行透明4、低浓度-高浓度循序进行(酒精是依次递增、水是级差递减)常用的各级酒精梯度，达到脱水目的【60% 70% 80% 90% 100% I 100% 】,常用的脱水剂 1、 酒精：特点：能力强，使组织硬化，和二甲苯互溶。 缺点：使组织收缩，变脆。 2、 丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用于快速脱水 3、 二氧陆环：有毒性，既脱水又透明使组织收缩小不硬化 4、 正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨 叔丁醇发松子醇 5、 脱水时间： 根据组织大小、类别、种属、分别安排,六、透明
11、(clearing)组织经脱水后，不能直接浸入石蜡中，还要一个媒剂透明过程。透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，当组织中全部被透明剂点有时，光线可以透过呈现透明状态-称组织透明。,常用的透明剂 1、 二甲苯：易挥发、易燃、透明力强、收缩、变脆(能与无水乙醇相混合，又能与石蜡相混合，作两组透明。) 2、 氯仿：比二甲苯透明力强，不收缩、变脆。时间长24h，收缩小 3、 苯：甲苯和二甲苯相同。易挥发、易燃、有毒性 香柏油,苯甲酸甲酯-收缩小、时间1224h，常用为火棉胶切片 俄甘油 苯酚,透明时间：眼观组织呈透明状态 小组织 10min 中组织 20-40 min 大组织 1-
12、2h(如果组织不透明1、脱水未尽2、组织太厚3、时间不够),七、浸蜡（Infilftrition）组织经过媒剂的透明作用后，移入熔化的石蜡内浸渍称为浸蜡。,、 石蜡： 切片蜡_软蜡50以下，酶，保存抗原活性 (纯度高密度好) 硬蜡50以上-6264 工业石蜡_质地较差，价格便宜纯度低，熔点不准确 2、根据组织的不同选用： 6062-皮肤、骨组织、硬纤维瘤 58以下-作免疫组化酶,3、恒温箱温度一般高于石蜡熔点45 4、浸蜡可分三级 软蜡 54-56硬蜡 58-60硬蜡 6062,八、包埋（Emledding）组织经过固定、脱水、透明、后再用石蜡铸成蜡块称包埋。1. 埋石蜡的要求：(1)尽可能和
13、浸蜡熔点一致(2)南方：5862 北方：5258 2. 方法：,3. (1) 最大平面向下压平(2) 管状 束壁 皮肤 竖埋(3)包埋石蜡温度高于石蜡熔点57(4)石蜡凝固后打开蜡框修整蜡块(5)贴好标签,九、石蜡切片法 1.切片前的准备工作： (1) 切片机A：轮转切片机B：平推式切片机 (2) 刀片(刀) 一次性刀片或切片刀(磨刀) (3) 清洁的载玻片 (4) 甘蛋白油、白胶、毛笔、钙子,2. 切片制作过程(实习) 注意事项： a) 切片厚度：5um(镜下46um) b) 刀片要锋利否则会出现卷片、起皱、不连结、破碎不完整。 c) 刀与组织的角度46 d) 各个部件，螺丝应旋紧否则震动切
14、片厚薄不均。,一、染色的目的病理学的各种切片，都必须应用一种以上的染料通过不同的方法将切片的各种不同的组织结构给予显示出来，以利于镜下辨别其各种不同的形态，做出正确的诊断。,十、染色,二、染色的作用1、化学作用：染液中的阴阳离子与组织中的阴阳离子相互作用所完成的染色。染液中有酸性和碱性染料之分，酸性染料有染色作用的部分是阴离子，而碱性染料有染色作用的部分则是阳离子。组织的各种细胞中细胞核为酸性，它可与苏木素液中的阳离子发生反应。细胞桨中的阳离子则与伊红液中的阴离子发生反应，完成染色。,2、物理作用：染料通过浸透，分散浸入到组织的间隙中，因受分子的引力作用，染液中的色素粒子被吸附而完成染色过程。
15、 3、染色方法应用于常规病理切片的染色方法称为普通染色法或HE染色法，而用特别的染色法则称为特殊染色法。,HE染色法程序,结果：细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深蓝色；细胞浆深浅不同的粉红色，嗜酸性颗粒鲜红色；胶原纤维呈粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，红血球为桔红色，蛋白基质为粉红色。,染色时的注意事项 （1）切片烘烤以切片附贴牢固为原则，否则容易掉片。 （2）切片脱蜡一定要彻底，不然会导致染色深浅不一。 （3）切片染苏木素前可令其无水化，这样可延长苏木素的寿命。因为每次染色前，切片水洗，然后进入染液虽然每次带入的水分很少，但随着次数的增加，所带入的水分足可以稀释染液影响染色的质量。,（
16、4）切片在苏木素的染色时间应充分宁过勿不足。对于初学者来说更应过染，否则分化会过度导致染色过浅。 （5）切片分化时，要根椐不同的组织来确定分化时间，并不断积累经验。 （6）伊红染色时间也要充分，经低浓度洒精时应仔细观察，必要时快速通过，以免过于褪色。,（7）切片致无水酒精后，不要在控干无水酒精时让切片干涸，可以不经控干直接地进入碳酸二甲苯（也可以进入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有较强的吸水性透明也好很适合南方地区。 （8）切片从二甲苯中取出封固时，切不能让其干涸，因南方地区空气潮湿干涸的切片与空气接触，可吸收其水份。这样的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被着二甲苯，由于它不溶于水起到与水隔绝的作
17、用。,（9）滴中性树胶封盖切片，胶不能太浓，太浓胶难以均匀铺开，且易产生气泡，又不能太稀过稀的胶由于二甲苯含量较多，当切片干燥时，二甲苯挥发掉，胶封的切片收缩，即可导致一半切片没有被胶封固的结果。最合适的胶应是滴下成珠。,（10）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶盖难以打开。因此每次用完后都必须将其擦干净。当打不开瓶盖时应放入烤箱中烘烤，即可打开。 （11）标签附贴要认真，不要贴得歪歪斜斜，影响切片的外观.,染液的配制 (一）苏木素的配制 1、苏木素的种类： A、明矾苏木素（Harris,Mayer, Ehrlich） B、铁苏木素（Wiegert,Heidnhain） C、
18、钨苏木素（PTAH） D、铅苏木素（Soecia）,（1）Harris苏木素的配制（Harris.l900） 苏木素 0.5g 无水乙醇 5ml 钾明矾（硫酸铝钾） 10g 蒸馏水 100ml 氧化汞 0.25g 冰醋酸 4ml,预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，于电炉上加热至90左右时，拔去电源加入酒精苏木素，再插上电源继续加热，持续35分钟，拔去电源，加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其溢出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续35分钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二
19、天过滤后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间515分钟。,（2）Mayer氏苏木素（Mayer,1903） 苏木素 0.1g 蒸镏水 100ml 钾明矾 5g 柠檬酸 0.1g 水合醛 5g 碘酸钠 20mg,将蒸包馏水稍为加温，加入苏木素不停地搅拌直至溶解，再加入钾明矾，令其溶解后再加入碘酸钠过滤后即可使用，染色时间1020分钟，如果先用天表蓝为媒染剂，染色时可在23分钟。,配制苏木素的注意事项 1、苏木素可以配成5%或10%，让其氧化产生苏木红，然后根椐每次配制溶液的量，再决定加入多少。 2、在配制苏木素时，三角烧瓶的选择也很重要，例如，配制500ml 的溶液，应选用15002000ml的三角
20、烧瓶，配制1000ml则可选3000ml的烧瓶，这样溶液在加入氧化汞时，才不会喷出瓶外。,3、冰醋酸一定要在溶液过滤后加入如果过滤前加入，则在过滤时溶液很难通过滤纸，这主要是冰醋酸草可造成对滤纸的损害。,(二）伊红的配制 1、1%伊红洒精的配制伊红（水溶） 5g70%-75%酒精 500ml取少许蒸馏水来溶解伊红或称曙红，当完全溶解后，再加入酒精，然后再加入少许冰醋酸，此时溶液即可变为鲜红色。 注意：冰醋酸一定要加进去如果没有加入冰醋酸，细胞浆将难以染得鲜艳。,2.切片染完苏木素后的分化，应该如何控制和注意什么问题？ （1）分化液中盐酸不能高于1%，否则会因分化过强而将已着色的颜色大部分脱水，
21、造成染色过浅。 （2）对各种组织应视情况而定，如淋巴结的切片，应分化较长时间等。 （3）分化完后，应在显微镜下观察，如发现核中的物质不清楚，则应继续分化至清晰为止。 （4）要认真操作，细心观察，不断总结。,胃类癌（瘤细胞小而一致）,瘤细胞的多形性,病理性核分裂像,平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤,大肠腺体、腺瘤和腺癌,正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌,淋巴管转移癌,肺淋巴管转移癌,冰冻切片,一、种类： 1、低温恒冷箱切片法 2、二氧化碳冰冻切片法 3、甲醇循环制冷冰冻切片法 4、半导体冰冻切片法 5、氯乙烷冰冻切片法,二、冰冻切片的目的 1、在手术进行中。突然发现病人的病变与原诊断不相符合或者怀
22、疑时需要病理给予确定。 2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞或者转移的程度，以利于确定以后的治疗措施。,3、对于已确定恶性肿瘤的病人则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤细胞。 4、在剖腹探查所发现的肿块。 5、显示组织中的脂肪类物质。 6、某些酶的显示如ATP酶琥珀酸脱氢酶等。 7、神经病理学中的某些染色法。 8、对某些物质所进行的免疫荧光的研究。,三、冰冻切片的操作 （1）本室现有Shandon-AS620E型冷冻切片机的主要性能。左边的切片台可达到-60左右，冷冻箱内在0-30间可任意调节，箱面上有电子控制板，装有急速冷冻，即放上标本启动该键机器马上进行冷冻工作并持续10
23、分钟；有冷冻台温度显示冷冻箱内温度显示；有即时除霜内温度显示；,有即时除霜键，启动该键机器可持续工作15分钟，将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉；有照明键，启动该键可照明工作间；有消毒键当进行一星期的工作后，启动该键可对工作间进行消毒；有工作间面的密锁键启动键可将工作间锁住，除此之外该机的左边有四个按键两个为快速自动进退、两个为微小进退、另有一个手动旋钮，调节修块时的进退。,（2）切片取末经固定的组织不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整。最好2424 4mm。 （3）取出组织支承器，放平摆好组织周边滴上包埋剂，速放入冷冻台上冰冻，小组织应先取一组织支承器滴上包埋剂让其冻成一个小台再放上细
24、小组织，滴上包埋剂。 （4）将冷冻好的组织块夹紧于切片机上修平切面。,（5）调好厚度，根椐不同的组织而定，一般在5-10um. （6）调好防卷板，制作冰冻切片的调节，关建在于防卷板的调节，这就要求要细心，准确，将其调校，调校至适当的位置，此时切片。冰冻切片在第一时间顺利地在刀与防卷板之间通过，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载片，将其附贴上即可。,（7）用于附贴切片的载片，不能存放入冷冻的地方，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的温差，当温度较高的载片附贴上温度低的切片时，由于两种物质温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子间的彼此转移而产生了一种吸附力。使切片与载片
25、牢固地附贴在一起。如果用冷藏的载片附贴切片，就没有这种现象发生。,（8）应视不同的组织选择不同冰冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根椐不同的组织而定，不能一概而论，例如：切未经固定的脑组织，肝脏组织和淋巴结组织等，冷冻箱的温度可调在-10-15左右。切甲状腺，脾、肾、肌肉等组织,则应调在-15 -20左右。切带有脂肪的组织如乳腺组织，应调在-25左右，如为大量的脂肪组织时，应调至-30。,四、冰冻切片时的注意事项 1、防卷板和切片及持刀架上的地方应保持干净经常用毛笔挑除切片残余及用柔软的纸张擦。因为包埋剂常常贴在上述的地方。如果不把它们去除掉，就会影响切片。使切片不能完整切出。 2、应用于冰冻切
26、片的组织不能过大过厚，过大难以切出好片过厚冰冻费时，最好的取材应在24 24 2cm。,3、冰冻组织前组织放于组织支承器上应视组织的走势来给予放置，然后四周加上包埋剂，保持周边的整齐，如出现凹凸不平的地方，可用刀子将其修平，才不致于影响切片。,4、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液在未能达到固定前更不能使用。临床快速冰冻切片不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织反而增加了切片的难度。如果使用了未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶，这是因为含水溶液的固定液在组织未经固定前，其中的水份也会渗入到组织当中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中形成了冰晶。,5、当切片时，
27、如果发现组织冰冻过度时，可将冰冻的组织取出来，于室温中停留片刻，以利于软化组织，使其不致于过度冰冻。,五、冰冻切片的快速染色 1、用普通染色进行染色（HE染色） （1）固定、切片用电吹风吹干后于10%的福尔马林盐或纯丙酮中固定2分钟后自来水冲洗。 （2）滴少许苏木素染液于切片上于酒精灯上加热染色，当见有蒸汽时即可中止染色，快速水洗、分化、用热水促其蓝化、伊红对比染色、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。,2、超声波快速染色法 （1）固定：切片的固定与上同。 （2）把水洗后的切片插入装有苏木素的玻璃瓶中超声波处理30sec或1min,水洗、分化、放于装有热水的玻璃瓶中、超声波处理30sec,酒精脱水，二甲苯透明封固。,结果：经上述各种方法的处理后所制作的切片。细胞核呈蓝色，软骨基质钙盐深蓝色，胞浆呈深度不同的粉红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，胶原纤维量粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，切片完整，未见有冰晶出现。,
