1、发育生物学,西北师范大学生命科学学院,DEVELOPMENTAL BIOLOGY,绪论 (Introduction),一、发育生物学的任务和研究对象 1. 发育生物学（developmental biology)是应用现代生物学技术研究生物体发育的过程及其变化机制的科学。它是20世纪50年代在胚胎学（embryology)的基础上，随着分子生物学、遗传学、细胞生物学和生物化学等学科的发展以及它们与胚胎学的相互渗透而兴起的一门新的前缘学科。 2. 发育生物学研究从生殖细胞发生、受精、胚胎发育、生长、成熟、衰老和死亡，即个体发育中生命现象发展的机制，以及异常发育如肿瘤、畸形等。,3. 发育生物学研
2、究的核心问题是细胞分化(cell differentiation).细胞分化是指由一种类型的细胞产生的细胞类型的多样性。 4. 发育生物学研究有机体细胞的每一个分子、每一个细胞、每一种组织、每一个器官和每一种有机体，因为它们的起源和形成都离不开发育。 珠蛋白基因的转录和青蛙鳃的形成对发育生物学家来说是同样正当的问题。发育生物学的研究并不局限于有机体的任一系统、组织或器官。这意味着发育生物学可能是生物学科的最广泛的概括。发育的研究把所有的生物学领域连接在一起。,二、发育的基本模式,（一） 发育的基本特点: 多细胞有机体的产生是一个相对缓慢和渐进的变化过程，我们将其称为发育（development
3、)。其特征是具有严格的时间和空间的次序性，这种次序性是由发育的遗传程序控制，发育是有机体的各种细胞协同作用的结果,也是一系列基因网络性调控的结果. 发育完成两大功能： 1.产生细胞的多样性和在每一代中的条理性。从单个的受精卵产生不同类型的细胞，如肌肉细胞、皮肤细胞、神经元、淋巴细胞、血细胞和所有其它类型的细胞。我们把细胞多样性的产生称为分化（differentiation)，是一个质变的过程。由已分化的细胞形成组织和器官的过程称为形态发生（morphogenesis)。发育的过程还包括生长（growth)，这是一个量变的过程。 2.确保从一代到下一代生命的连续性,即增殖（reproductio
4、n).以保证该物种新个体的持续产生。,（二）发育的基本过程：,1. 配子发生(gametogenesis) ：产生成熟的精子（sperm)和卵子(ovum)的过程。 2. 受精(fertilization)：为精子和卵子相遇并结合的过程。 3.卵裂(cleavage)和囊胚(blastula)：受精卵连续分裂，产生的细胞称为卵裂球（blastomeres)，然后由它们形成多细胞的囊胚。 4.原肠形成(gastrulation): 囊胚的细胞经过多种多样的形态发生运动（morphogenetic movement）产生由外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)和内胚层(endode
5、rm)组成的原肠胚（gastrula）。 5.器官发生（organgenesis）：三胚层的细胞相互作用分化形成各种不同器官的原基。 6.变态(metamorphosis)：有些动物，如两栖类和昆虫，在发育过程中经历一个幼虫（larva）阶段，然后经过“脱胎换骨”的变化发育为成体的过程。,三、发育生物学的发展简史,发育生物学是由于细胞生物学、遗传学、生物化学及分子生物学等其他生命学科的发展和与胚胎学的相互渗透，在胚胎学的基础上发展和形成的一门新兴的生命科学。 （一） 先成论(preformation)和后成论(epigenesis) 早在公元前, Aristotle (384一322)认为动物
6、胚胎和成体动物各种结构形成的原因只有两种可能：一是卵子或精子中本来具有微小的结构，在发育过程中逐渐长大形成胚胎和成体的结构；二是卵子或精子中本来并不具有这些结构，而是在发育过程中逐渐形成的.在观察鸡和一些无脊椎动物胚胎发育的基础上，他首先提出了胚胎是由简单到复杂 逐渐发育形成的（后成论）。 但到了公元17世纪后期和18世纪，以精源学说和卵源学说为代表的先成论占统治地位。 精源学说认为胚胎预先存在于精子中，卵源学说则认为卵子中本来就存在微小的胚胎雏形。其共同点都认为胚胎是成体的雏形，是配子中本来固有的结构,胚胎发育仅仅是原有结构的增大。 1759年德国Wollf(Theoria Generati
7、onis和Formatione Intestinorum)再次提出了后成论观点。Wollf根椐对鸡胚发育的观察，认为卵子中本来并不存在胚胎结构，胚胎与成体也并不相同，胚胎发育是逐渐变化的过程。后成论直到19世纪才为人们所接受。,（二）胚胎学(embryology) 1. 描述胚胎学(descriptive embryology) 2.比较胚胎学(comparative embryology): 重演学说(recapitulation theory)或生物发生律(biogenetic law)和进化论(evolution theory)。 3.实验胚胎学(experimental embryol
8、ogy): 镶嵌型发育(mosaic development; Weismann, determinant; Roux)和调整型发育(regulative development; Driesch) 胚胎是由一个单细胞的合子经过一系列的分裂和分化产生的。19世纪80年代, Weismann就提出了关于细胞、染色体和基因与胚胎发育关系的理论。他认为合子的细胞核含有大量特殊的信息物质决定子(determinants),在卵裂的过程中被平均分配到子细胞中去控制子细胞的发育命运。细胞的命运实际上是由卵裂时所获得的合子核信息早已预定的。这一类型发育称为嵌合型发育。,Weismann理论的核心强调早期卵裂
9、必须是不对称分裂。由于合子成分的不均匀分布，其卵裂的结果产生的子细胞彼此之间是完全不同的。 胚胎学家Roux(1887) 用烧热的针破坏两细胞期蛙胚的一个分裂球，结果存活的另一个分裂球只发育为半个胚胎。由此他认为蛙的胚胎发育存在嵌合型发育机制，细胞的特征和命运是在卵裂的过程中决定的。 但是Driesch (1891)用海胆为实验材料重复Roux的实验却得到了完全不同的结果。他在海胆两细胞时期将两个分裂球分开,得到了两个发育正常的、个体较小的 海胆幼体。Driesch的实验结果第一次证明发育过程中存在调整型发育机制。,4.胚胎诱导作用(embryonic induction)和组织者(organ
10、izer; Spemann和Mangold, 1924)Driesch(1876-1941)提出的调整型发育机制已经涉及细胞之间的相互作用，但是一直到诱导现象发现之后，人们才真正认识到，细胞之间的相互作用是胚胎发育最重要的核心问题. 诱导是指一类组织与另一类组织的相互作用，前者称为诱导者(inductor) ,后者称反应组织，诱导者可指令邻近反应组织的发育. 1924年Spemann进行了著名的胚孔背唇移植实验。将蝾螈原肠胚早期的胚孔背唇组织移植到另一同期受体胚胎的胚孔侧唇表面，随着受体胚胎发育的进程，大部分移植组织也内陷进入胚胎内，发现到原肠胚后期诱导产生了另一个次生胚。 由于胚孔背唇组织具
11、有调控和组织一个几乎完整的胚胎产生的特殊能力,故称组织者。发育中的诱导和细胞之间相互作用的重要性才因此得到充分的重视。由此重大发现, Spemann 在1935年获得 诺贝尔医学奖.,（三） 细胞学理论和胚胎学 1839年德国植物学家Schleiden和生理学家Schwann指出，所有生物有机体都由细胞构成，细胞是生命的基本单位；通过细胞的有丝分裂产生其他细胞。因此发育也必然是逐渐变化的过程.在胚胎发育中,通过受精卵的分裂产生许多新细胞和新的细胞类型. 到19世纪40年代，对卵子的特性开始有所认识，认识到卵子也是一个细胞（一个特殊细胞）。Weismann进一步提出后代所具有的双亲遗传特性来自于
12、生殖细胞，来自于两性配子所携带的遗传特性。之后对海胆等的研究进一步显示，在受精初期受精卵中包含两个细胞核，其中一个来源于卵子，另一个来源于精子，在受精过程中两个细胞核融合。 到19世纪后期，人们通过一系列研究 认识到，合子细胞核的染色体中各有一半分别来源于两个亲代，而合子的遗传信息在卵裂过程中平均分配到子细胞中去，这就为遗传特性的传递提供了物质基础。,（四）胚胎学和遗传学的结合 Boveri (1902)对海胆的研究发现，正常的胚胎发育决定于正常的染色体组型.之后的研究进一步提出基因型(genotype)与表型(phenotype)的概念。基因型是有机体从双亲获得的遗传信息所赋有的特性.有机体
13、在不同发育时期表现出来的形态、结构、生化等特征称为表型。由基因型控制发育，同时有机体的表型又受到环境因子与基因型的共同影响。如孪生兄弟。所以发育实际上看作是基因型与表型的结合. 发育受遗传信息的控制，在发育过程中合子从双亲获得的遗传信息是如何表达的，一个单细胞的合子又是如何发育成为具有功能的有机体的，要回答这些难题，需要将遗传学和胚胎学的研究结合起来。随着基因编码蛋白质的发现，不少问题迎刃而解. 细胞的性质是由细胞中所包含的蛋白质决定的，而这些蛋白质由基因编码。基因通过其编码产物蛋白质的变化控制发育分化中细胞的性质和习性.遗传和发育是个体发生过程的两个方面。对于发育性状的研究，既可以从遗传现象
14、出现的角度进行研究，又可以从发育过程进行研究。发育受遗传程序的控制，遗传特性通过发育展现出来.,（五）分子生物学和发育生物学 发育生物学是个新兴学科。自从Watson和Crick (1953)根据X衍射和化学分析提出DNA分子的双螺旋模型以后，特别是60年代Nirenberg对DNA遗传密码的破译，Jacob和Monocl(1960)提出并证明蛋白质合成调控机制的操纵子学说等研究成果，使分子生物学迅速发展. 分子生物学与遗传学的结合，人们逐渐认识到遗传信息主要是编码在细胞核内基因组DNA的一级序列，发育受遗传的控制。为回答发育的遗传程序是以何种方式编码在基因组 DNA上，编码在DNA上的遗传信
15、息又如何控制生物体的发育等问题，人们开始采用分子生物学方法和各种新兴的生物学技术，进行发育机制的研究. 目前对于果蝇和线虫发育的分子控制机制已基本阐明。在此基础上，利用发育调控基因在进化上的保守性，开展了对脊椎动物发育分子机制的深入研究，对于斑马鱼、非洲爪瞻、小鼠、鸡和文昌鱼等模式动物的研究已取得一系列重大的突破.由于发育生物学的迅速发展，发育生物学已成为当代生命科学研究的前沿和热点领域之一.,四、发育生物学模式生物,现代发育生物学研究主要集中于几种模式生物，包括果蝇、线虫、非洲瓜瞻、斑马鱼、鸡和小鼠等。对于发育分子机制的认识也主要来源于对这些模式生物的研究。 模式动物各有优缺点,但都具备一些
16、共同特征： 取材方便。在实验室条件下，这些动物常年可产卵，随时可获得胚胎材料，饲养管理简单，维持费用低。 胚胎具有较强的可操作性。胚胎一般较大，相关实验技术如显微注射等比较完善。 可进行遗传学研究。上述物种中果蝇、线虫和斑马鱼均可用于大规模遗传突变研究，小鼠的基因敲除技术已相当完善，非洲爪瞻的转基因技术较有优势。 此外,棘皮动物海胆和尾索动物海鞘也都是较为常用的模式动物,文昌鱼是研究动物进化的模式生物,水螅涡虫常被用予再生机制的研究,（一）脊椎动物模式生物,1.两栖类：非洲爪蟾(Xenopus laevis) 两栖类动物是早期胚胎学研究的经典动物模型。在20世纪早期，常用的动物是蝾螈和蜥蜴，5
17、0年代以后，非洲爪瞻逐渐成为主要两栖类动物模型。 非洲爪瞻的优势是: 取卵方便.在实验室条件下，非洲爪蟾可常年产卵，不受季节限制。只需要注射激素，雌体第2天就可产卵 产卵量大,卵可通过人工授精获得受精卵。 卵子和胚胎个体较大,直径可达1. 4mm,很方便进行实验胚胎学研究，如显微注射、胚胎切割和移植等。 早期胚胎发育很快，在24oC下受精后 2 天左右就可以孵化为可自由游动的幼虫.非洲瓜蟾的研究为我们认识脊椎动物的发育机制做出了重要贡献。,非洲爪蟾的生命周期如图绪. 1。 非洲爪瞻的成熟卵子具有明确的动物极和植物极之分。动物极含有大量色素颗粒而卵黄较少，植物极则含有丰富的卵黄而色素颗粒较少。受
18、精时精子于动物半球的任意位点人卵。受精作用引起皮质运动(cortical rotation) ，质膜下的皮质胞质相对于内部的胞质部分旋转约30o。在这一过程中原来位于植物半球的背部决定因子被转运至精子人卵处的对侧，即未来胚胎的背侧 爪蟾胚胎经过卵裂、囊胚（3.5 h）、原肠胚(11 h)、神经胚(18 h)及尾芽期(25 h)等阶段孵化成为幼虫(66 h)。蝌蚪在5天左右后肢开始发育并逐渐进入变态期，到2个月时完成变态。 幼体要生长1 -2年才能达到性成熟。,虽然X. laevis作为动物模型有许多优点，但也存在着重要缺陷，即很难进行遗传学研究。主要是由于其生命周期过长，同时，X. laevi
19、s是异源四倍体，多数基因都存在4个拷贝，很难进行遗传突变实验。 近年来，另一个X. laevis的近缘品种一X.tropicalis开始进入人们的视野。与X. laevis相比，X. tropicalis个体较小，世代周期短(约4个月) ，是二倍体品种，因而比较适于进行遗传学实验。它同时也具备X. laevis所具有的实验胚胎学研究优势，如激素诱导产卵，产卵量大等。X. tropicalis的卵直径0.6 -0.7 mm，足以进行显微操作实验。在X. laevis中建立的实验方法均可直接应用于X. tropicalis中。目前X. tropicalis的基因组测序已接近完成。X. tropic
20、alis有望成为重要的发育遗传学研究模型。,2.鱼类：斑马鱼(Danio rerio),20世纪60年代，美国Oregon大学Streisinger G就开始了对斑马鱼的研究。90年代，由Nilsslein Volhard C和Driever W分别领导的实验室开展了斑马鱼的大规模突变筛选，得到了大约4000个突变品系。此次筛选成为斑马鱼研究领域的里程碑。此后斑马鱼的研究得到了迅速发展。 斑马鱼作为发育生物学模式生物有两个明显的优势：一是世代周期短(约3个月) ，二是胚胎透明，易于观察，同时饲养管理较为简单，容易进行杂交实验。斑马鱼是目前唯一可以进行大规模遗传突变筛选的脊椎动物. 斑马鱼的基因
21、组测序已接近完成，相关的遗传学和形态学研究技术也比较完善，斑马鱼已成为最好的脊椎动物发育遗传学研究体系之一.,斑马鱼的卵属于端黄卵，胚盘位于卵黄之上。早期的卵裂为盘状不完全卵裂，囊胚期胚胎形成一个细胞球位于卵黄上，而囊胚腔并不明显。位于囊胚边缘的细胞与卵黄并不完全分隔。到囊胚期，这些细胞与卵黄细胞融合，形成一个合胞体层，称为卵黄合胞体层(yolkl syncytial layer，YSL)。 到囊胚晚期，卵黄合胞体层与胚盘开始向下包被。到原肠作用结束时,卵黄细胞被完全包被在胚胎内部。原肠作用后，体节、神经管和其他器官原基开始出现。斑马鱼胚胎在受精后48 h左右开始孵化为自由游动的幼体。,3.鸟
22、类：鸡,鸡的胚胎发育过程与哺乳动物更为接近. 由于鸡胚在体外发育，相对于哺乳动物更容易进行实验研究，相应的研究手段已比较成熟。鸡胚是研究附肢、体节等器官发育机制的重要模型。鸡的基因组测序也已完成。 鸡卵在输卵管内完成受精，在排卵过程中逐渐包被上卵清、壳膜和蛋壳。卵细胞质和核位于卵黄上方2-3mm的狭小区域。受精卵经卵裂形成胚盘，胚盘中央逐渐与卵黄分离，形成胚下腔。随后一部分细胞迁移至胚下腔内卵黄上方，形成下胚层，位于表面的胚层为上胚层，两者之间为囊胚腔。 上胚层后部细胞向中间迁移，使中央部分加厚形成原条，原条逐渐向前延伸，其最前端细胞变得更密集，称为亨氏结(Hensens node)。预定中胚
23、层和内胚层细胞通过原条中央的原沟迁入囊胚腔内部-即原肠作用。随后原条开始逐渐回缩，胚胎开始出现脊索、体节、神经板等结构。伴随其发育，胚胎还形成复杂的胚外膜系统，包括卵黄囊、尿囊等。卵黄囊为胚胎的发育提供营养，而尿囊是胚胎的呼吸器官并贮存代谢废物。,鸡胚在孵育21天后孵化成为小鸡,4.哺乳动物：小鼠,胚胎发育过程与人类比较接近，作为很多人类疾病的动物模型 小鼠的世代周期约 2个月，这在哺乳动物中是相当短的。其基因组测序已经完成，遗传学背景较为清楚，相应的遗传学实验手段如转基因、基因敲除等也比较完善。小鼠是目前唯一可以进行基因敲除实验的脊椎动物。 最大缺点是其胚胎在母体内发育，胚胎个体很小，很难实
24、验操作. 小鼠成熟卵外包被透明带(zona pellucida )，受精和卵裂均在输卵管内进行.在8细胞时胚胎发生紧密化(compaction)形成实心球体，至32细胞时称桑椹胚(morula).此后出现囊胚腔.胚胎分化为滋养外胚层(trophectoderm )和内细胞团(inner cell lPass)胚泡(blastocyst)。内细胞团将发育成为胚胎本身，而滋养外胚层发育为胚外组织。E4.5天时胚泡到达子宫从透明带中孵出并植入子宫壁。此后小鼠胚胎的发育过程与鸡胚类似.,内细胞团逐渐发育为一个中空的柱状结构，称为卵柱(egg cylinder) .卵柱中位于囊胚腔表面的细胞分化为脏壁内
25、胚层(visceral endoderm) ,与鸡胚的下胚层相当，将来分化为胚外组织; 而位于内部的内胚团细胞与鸡胚的上胚层相当.卵柱中央的腔将来成为羊膜腔. 在E6.5天时，在上胚层一侧出现原条, 原条向前延伸，其前端出现原节(node.)。胚胎的预定中胚层和内胚层细胞通过原条迁入胚胎内部。随后原条回缩,胚胎开始出现神经板、脊索、体节等。 到E8. 5天，胚胎的头褶(head fold)已相当清楚.胚胎开始沿它的长轴扭转，经扭转过程，胚胎被羊膜和羊膜液完全包围.,小鼠幼仔在受孕后19 - 20天出生,(二)无脊椎动物模式生物,1.果蝇(Drosophila melanogaster) 果蝇是
26、遗传学的经典模式生物，已有100多年的研究历史。但作为发育生物学研究模型，在早期并未受到重视。1980年初，德国科学家Nesslein-Volhard C和美国学者Weichaus E以果蝇作为材料，研究发育调控的遗传基础，他们和另一位美国遗传学家Lewis E B分享 了1995年诺贝尔生理学或医学奖。 果蝇为双翅目昆虫，个体小，生命周期短，繁殖容易，操作简便，成本低廉，其胚胎和成体都具有丰富的表型特征。 果蝇是目前遗传学背景最清楚的物种，其基因组序列测序已全部完成(约包含13 600个基因)，相关遗传学研究手段非常完备，在长期的遗传学研究过程中积累了大量遗传突变品系，为果蝇的发育遗传学研究
27、提供了有利条件。,果蝇在25 0C下由卵至成虫约需11天，经过卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。果蝇卵呈长椭圆形，精子通过卵壳前部的卵孔入卵.其胚胎发育很快，受精卵在24h内就可以孵化为幼虫. 卵裂为表面卵裂。在早期阶段，合子核进行一系列快速分裂，而胞质不分裂，形成合胞体(syncytium).核第8次分裂后,在胚胎最后部的核最先被细胞膜分隔形成极细胞，将形成生殖细胞。核第9次分裂后，大部分核开始迁移到卵的边缘，称为合胞体胚盘(syncytial blastoderm). 受精约3个小时后，卵周边的核被新形成的胞膜包围，形成细胞化胚盘(celluar blastoderm). 原肠作用过程(图绪.8
28、)中，先是胚胎腹侧的预定中胚层细胞沿腹中线内陷，形成腹沟(ventral furrow)。随后这部分细胞与表层组织分离，形成中胚层管。这些细胞将迁移至外胚层下，发育成为肌肉和其他结缔组织。随着中胚层组织的内陷，原来位于胚胎背侧的细胞也逐渐向腹侧迁移集中。仍停留在背侧的少量细胞不再继续分裂，也不参与胚胎本身的构成，而是形成胚外组织，称为羊浆膜(amnioserosa) 。而集中于胚胎腹侧的细胞带称为胚带(germ band)。,胚带包含了外胚层和位于其下方的中胚层组织，将来形成胚胎的主体结构，也是将要分节的部分。位于外胚层最腹侧的预定神经母细胞逐渐陷入胚胎内部，发育为神经组织。位于腹沟前后两端的
29、内胚层细胞也分别内陷，分别形成中肠的前部和后部，两者随后融合形成完整的中肠。在中肠细胞内陷时，在其前后部同时带人一部分外胚层细胞内陷，分别形成前肠和后肠。 随着原肠作用的进行，胚带开始延伸，胚带后端不断向背侧延伸并折向前方。 到胚带延伸完成时，胚带开始出现分节。胚胎的表皮出现一系列均匀分布的小沟，将胚胎分为14个区域，此时出现的分节是副体节。副体节与后来的体节在位置上并不对应，每一体节包含前一副体节的后2/3与后一副体节的前1/3。副体节在胚胎发育中的出现是短暂的，但它奠定了胚胎躯体结构划分的基础，也是许多分节基因表达区域的基本单位。大约在7.5 h胚带开始回缩，在这一过程中胚胎开始出现明确的
30、体节，包括3个头部体节，3个胸部体节，8个腹部体节和1个尾节.,果蝇胚胎大约在受精后24 h孵出成为幼虫。幼虫要经过两次蜕皮，因此分为1、2、3龄幼虫。幼虫表皮具有规则分布的齿状突起带(denticle belt)，这些突起带的形状和大小具有体节特异性，这些是研究果蝇胚胎前一后轴和背-腹轴发育的重要表型依据。 果蝇的3 龄幼虫化成蛹，在激素刺激下发生变态，由幼虫变为成虫。在变态过程中大部分幼虫组织被吸收而被成体结构所代替。果蝇成体的许多结构都是由成虫盘(imaginal disc)发育而来的，包括腿、翅膀、眼睛、触角及生殖腺等。 成虫盘是在胚胎发育阶段由特定区域的表皮细胞群内陷形成的囊状结构。
31、,2. 线虫：秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) 英国科学家Sydney Brenner在20世纪60年代开始选择线虫作为发育生物学模式动物，他与其合作者H Robert Horvitz和John E Sulston获得了2002 年的诺贝尔生理学或医学奖。 线虫成虫仅约1mm长，构造简单，全身透明，细胞数目少，发育中的细胞谱系(cell lineage)几乎固定，易于追踪。线虫生命周期短，培养简单，便于遗传突变筛选，并可用液氮长期保存。 线虫的基因组测序已在1998年完成(共含19 099个基因) ，是第一个完成全基因组测序的多细胞动物. 线虫分雌雄同体和雄性两性别
32、，雌雄同体为主要形式.雌雄同体个体的性染色体为xx型，而雄性个体为xo型，只一条性染色体.雄体是减数分裂过程中由于染色体丢失造成的。 雌雄同体个体可通过自体受精产生后代，也可与雄性个体交配异体受精。成熟的雌雄同体个体具有959个体细胞，约2 000个生殖细胞。雄虫则有1 031个体细胞和约1 000个生殖细胞.,线虫大致呈圆柱形，外表覆有角质化层，下方为下皮层(hypodermis)，然后是肌肉。消化系统包括咽和肠道。其体腔为假体腔，体腔周围没有中胚层细胞包被。 雌雄同体性腺为双臂状，开口至腹侧中部的阴门。在性腺中，距阴门最近的细胞分化为精子贮存于体内。卵子细胞核产生于性腺远端，通过减数分裂形
33、成，它们最初以合胞体状态存在，直到受精前才形成完整的细胞膜。卵子在产出的过程中受精，在排出母体时通常处于卵裂阶段(约40个细胞)。 雄体性腺为单臂状，只能产生精子。 在250C条件下，线虫完成一个生命周期约需2.5天(图绪.9)。胚胎的前后轴是由精子人卵处决定的，精子入卵的部分成为胚胎的后端。精子入卵引起卵质的重组，受精卵中间部分出现一个“分裂沟”， 但此时并不真正分裂，称为“假卵裂” ( pseudocleavage) .合子卵裂为不对称卵裂(图绪.10),第一次卵裂后前部的细胞为AB细胞，而后段的细胞称为P细胞。AB细胞继续分裂为ABa和ABp细胞。而P细胞后几次的分裂方式则类似干细胞，即
34、每次分裂后都保持其中一个细胞为P细胞,另外一个细胞分别为EMS, C和D细胞(图绪.10)。P4 细胞是生殖细胞前体。EMS细胞继续分裂为一个E细胞和一个MS细胞.E细胞将发育为内胚层细胞。 线虫胚胎的“原肠作用” 持续时间较长。在28细胞时期，两个E细胞开始向内部迁移，此时可以算作是原肠作用的开始。随后由C和D细胞产生的肌细胞和由ABa细胞产生的咽细胞也依次由腹裂(ventral cleft)卷入胚胎内部。 胚胎的腹裂相当于胚孔。腹裂在290细胞时期合。胚胎在受精后约14 h孵化成为幼虫。 线虫胚胎发育过程中的细胞分裂方式一成不变，其细胞谱系已被完全确定(图绪.11).幼虫经4次蜕皮成为成体
35、，然后在3天内产下300多个卵，并在2周后死亡.,五、发育生物学研究技术,(一)常用发育生物学研究技术 1.显微镜技术 由于胚胎个体通常很小，显微镜和解剖镜仍是发育生物学研究的必备工具。除了常规的光学显微镜外，一些特殊的显微镜也广泛用于发育生物学研究。例如，相差显微镜(phase contrast microscope)和微分干涉差显微镜(differential interference. contrast microscope)适用于观察活的或未染色的样品的精细结构. A.光镜技术 取材、固定、脱水、包埋、制片、染色、观察,B.电镜技术 透射电镜术:取材、固定、脱水、包埋、制片、染色、观察
36、 组织块(lmm3)用戊二醛与饿酸两次固定，脱水后树脂包埋，用超薄切片机切片，再经醋酸铀和拧橡酸铅染色。 电子束射落到切片时，随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、饿的程度不同,而发生相应的电子散射。当电子束技射到密度大、吸附重金属多的结构(如溶酶体)时，电子被散射得多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，习惯称该结构为高电子密度；反之呈浅灰色，称低电子密度。 扫描电镜术：不需要制备切片，组织块(约0.3cm大小)用戊二醛和饿酸固定，经脱水干燥，表面喷镀薄层碳与金属膜，观察.,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscop
37、e)是20世纪80年代初研制成功的一种高光敏度、高分辨率的新型仪器，近年来在发育生物学领域得到了广泛的应用. 共聚焦显微镜是在荧光显微镜基础上发展起来的。某些荧光物质(如荧光标记染料或荧光蛋白)在一定波长的激发光照射下会发出荧光。利用荧光染料标记的特异性抗体或探针，可对胚胎或细胞中的特定蛋白或mRNA的分布进行定性和定量研究。 传统的荧光显微镜的最大缺点是成像质量差。共聚焦显微镜技术很好地解决了这一问题。,2.组织切片技术 要观察到胚胎的内部结构，通常要进行组织切片。 最常用的技术是石蜡切片技术。 石蜡切片术(paraffin sectioning)：取材、固定、脱水、包埋、切片(510m 厚
38、)(连续切片）、贴片、脱蜡、染色、观察 苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining， HE染色法)：苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料使胞质和细胞外基质着红色 冷冻切片是利用特殊的低温包埋剂对样品进行包埋，在低温条件下进行切片的技术。通常冷冻切片的质量比石蜡切片要差，也很难进行连续切片，但方便快捷,对样品中蛋白质和核酸的保存也较好。,特殊染色 用硝酸银将神经细胞染为黑色(镀银染色法) 用醛复红将弹性纤维和肥大细胞的分泌颗粒染为紫色. 活体染色 将无毒或毒性小的染料经静脉注入后，再取材制成切片观察.如注入的台盼蓝(trypan blue)可被
39、肝、脾器官内的巨噬细胞吞噬. 在组织化学术,常使用荧光染料染色或作为标记物,用荧光显微镜观察,3.免疫组织化学（immunohistochemistry） 根据抗原、抗体特异性结合原理，检测组织切片中的肽和蛋白质 用标记的抗体与组织中的抗原结合，标记物可于显微镜下观察。 肽和蛋白质均具有抗原性。当把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物，其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后，与标记物相结合，即成为标记抗体。用后者与组织切片孵育，抗体则与组织中相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。 标记物有荧光素（荧光显微镜观察）
40、、辣根过氧化物酶（光镜或电镜观察）、胶体金（多用于电镜观察）,免疫组织化学(辣根过氧化物酶标记) 胰岛B细胞呈胰岛素阳性,免疫组织化学(荧光素标记) 毛血管内皮细胞呈vWF阳性,4.分子生物学技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR) ，反转录PCR (RT ：- PCR) ， Northern印迹杂交，Western 印迹杂交，免疫共沉淀技术等都常用于发育生物学研究，如用于检测目的基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中的表达。 5.原位杂交技术 核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（mRNA）。 原理：用带标记物的已知
41、碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示和检测，而获知待测核酸的有无及相对量。 常用标记物有放射性核素35S、32P、3H和地高辛,6.显微注射 显微注射技术可将外源DNA、RNA或标记物等导人早期胚胎细胞中。 在非洲爪瞻和斑马鱼中, 用于对基因功能的研究和细胞谱系的标记研究。 在果蝇和小鼠中，常用于转基因动物的构建. 由于不同动物胚胎大小差异很大，显微注射所需显微操作系统也有所差异。非洲瓜蟾和斑马鱼胚胎可在解剖镜下操作，而小鼠和果蝇胚胎需在显微镜下操作。,原位杂交 脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性,7.报道基因技术 常用于启动子/增强子的
42、分析研究。采用一些产物易于检测的基因(即报道基因，reporter gene)与待研究的表达调控序列串联,然后通过转基因技术导入胚胎体内，通过分析报道基因产物的表达来研究目的片段的转录调节活性。 常用的报道基因有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和lacZ基因。 GFP的分布可在荧光显微镜下直接观察；lacZ基因编码-半乳糖苷酶，可以用特异底物进行显色而研究其产物分布。 荧光素酶(luciferase)报道基因以往常用于体外条件下基因表达活性的定量分析，特别是作为报道基因用于信号传递途径的研究，近年来，随着高灵敏度的检测技术的发展，人们已经能够对胚胎甚至
43、成体小鼠体内的荧光分布进行成像，荧光素酶报道基因也开始被用于体内研究。,8.细胞标记技术 研究胚胎早期卵裂球分化命运.在胚胎移植实验中标记供体或受体组织，在显微注射实验中追踪被注射卵裂球的命运与表型等. 早期常用的标记物包括活体染料尼罗蓝和中性红，使用方便，价格便宜，但很难标记胚胎内部组织，随胚胎发育染料会有扩散和衰退现象. 现在细胞外标记染料常用亲脂性荧光染料DiI和DiO.它会溶于标记细胞的细胞膜中并很好地保存于子代细胞中。在紫外线照射下，DiI会发出红色荧光，而DiO会发出绿色荧光。其缺点是会溶于有机溶剂，不适于需进行组织切片的实验。细胞内标记物常用荧光标记葡聚糖和辣根过氧化物酶，这些标
44、记物不会在细胞间扩散，示踪比较准确。 细胞内标记物需通过显微注射导入细胞内，通过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。在显微注射实验中，较常用的示踪基因是GFP和lacZ基因，即将GFP或lacZ mRNA与要研究的活性物质共同注射入胚胎卵裂球中，通过观察胚胎中GFP或-半乳糖苷酶的分布来确定获得注射物质的组织。,(二)发育遗传学技术 发育生物学的基本任务之一是研究基因在胚胎发育中的作用。 这一问题可以从两个方向研究。一是正向遗传学手段,即大规模随机诱变，产生发育异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。二是反向遗传学方法，即通过功能丧失(loss of function)或功能获得(gain of
45、function)方法对已知基因进行功能研究。,1.正向遗传学技术 A.大规模诱变筛选 诱变筛选通常是通过射线或化学诱变剂处理父本个体,在其生殖系细胞中产生随机突变，然后与野生型母本个体杂交，子一代(Fl)个体中就有可能携带基因突变,而每一个体携带的基因突变可能都不同于其他个体. Fl中的每一个体再与野生型个体杂交，所产生的每一子二代(F2)群体再进行群体内的杂交. 如果Fl 个体携带有基因突变，F2个体中就会有一半个体是杂合突变体，在F3代中有1/4的交配组合的后代中就有可能出现纯合突变个体而表现出某种发育异常.,突变发生后出现的表型改变是多种多样的，有的可能十分微弱，需要精细的生化技术才能
46、检测出与野生型的差别，有的突变可能是致死的。 最常见的基因突变类型是功能丧失，即突变后的蛋白质比野生型蛋白质活性差。导致某一蛋白质完全失活的突变称为无效突变(null mutation)。有时同一基因会出现一系列不同程度的功能丧失性突变。在有些情况下突变也可能是获得功能性的，如某些受体或转录因子可能会由于突变而持续活化。对果蝇常染色体隐性突变筛选,引入了平衡染色体(halanGer chromosome).平衡染色体有3个特点：一是含有大规模的染色体易位，具有正常功能但不会与相应染色体间进行同源重组，保证了突变的遗传稳定性。二是该染色体上含有一个显性标记基因，便于鉴别含有该染色体的个体。三是在
47、纯合状态下是致死的。,用于进行化学诱变的果蝇品系相应染色体中带有一个隐性标记基因.经过化学诱变的雄性个体与携带平衡染色体的雌性个体杂交，通过表型检测挑选Fl代个体中带有平衡染色体的雄性个体进行下一步的杂交。 与Fl个体杂交的雌性个体中相应染色体上带有一 个温度敏感型的致死基因。在290C培养时携带这一基因的胚胎会死亡.这样，在F2代中，存活个体都有带有一条平衡染色体和一条可能带有突变基因的染色体. F2代雌雄个体间交配产生F3代个体. 如果Fl代中的果蝇个体相应染色体上带有基因突变，在F3代个体中就会产生该基因的纯合突变体。如果该突变不致死，相应个体就会出现父本个体所携带的隐性表型；如果是致死
48、的就要检查死亡胚胎所出现的表型。而F3代中存活但不表现出父本表型的个体为携带有平衡染色体的杂合突变体,可用于该品系的保存.,B.插入诱变筛选(insertional mutagenesis screen) 利用转座子(transposon)或病毒载体作为诱变剂。 在果蝇中最常用的转座子是p-因子(P-element) .p-因子存在于某些果蝇类群中，可随机插入基因组中，并可在基因组中移动。 一个完整的p-因子包括转座所需的特殊序列(包括末端重复序列等)和一个转座酶编码基因。在插入突变筛选中采用的P-因子是缺陷型的，缺乏有功能的转座酶基因。 p-因子介导的插入突变筛选通过不同品系果蝇的杂交来实现
49、。其中一个品系携带有缺陷型的p-因子，而另一个品系携带有转座酶，在其后代个体生殖细胞中，转座酶就会诱导p-因子在基因组中的随机转座并有可能造成某些基因的突变。这些个体再与野生型个体杂交，其后代中就会含有杂合突变个体，同时p-因子与转座酶基因通常会分离，从而保证其后代突变的稳定性。这些杂合突变体再通过近交就可以获得纯合突变体并加以研究。,该方法的不足处是p-因子的插入位点并不是完全随机的，它不能覆盖基因组中的全部基因。反转录病毒是一类RNA病毒，它们进入宿主细胞中后所携带的RNA逆转录为DNA并随机整合入宿主基因组中. 利用这一特性人们构建了缺陷型反转录病毒载体用于转基因研究。这类载体具有随机整
50、合入宿主基因组的能力，也可用于随机插入诱变筛选。这一方法在小鼠和斑马鱼中应用较多。,C.突变基因的克隆 获得感兴趣的突变体后, 就要克隆引起该突变的基因 对于p-因子或病毒载体引起的插人突变，基因的克隆可利用p-因子序列作为探针，从该突变体的基因组文库中筛选出含有P一因子的克隆，从而确定p-因子的插人位点及被阻断的基因。也可通过PCR方法确定其插入位点。 对于化学诱变剂或射线照射引起的突变，基因的克隆就困难得多,多数情况下要采用定位克隆(positional cloning)的办法。 定位克隆是根据目的基因在染色体上的位置进行基因分离。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变基因的染色体位置。目的基因染色体定位的精确程度是定位克隆成功的关键，它取决于巳知染色体分子标记的精细程度并需要足够大的突变体类群。,
